EXPRESIÓN HÍBRIDA DE PROTEÍNAS E NEISSERIALES.

Una proteína híbrida de fórmula NH 2-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína Δ

G287 de Neisseria, y B comprende la proteína 961 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:8, o es una secuencia que tiene más de 70% de identidad de secuencia con ésta

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08075111.

Solicitante: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L..

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA FIORENTINA 1 53100 SIENA (SI) ITALIA.

Inventor/es: PIZZA, MARIAGRAZIA, GIULIANI, MARZIA, MONICA, COMANDUCCI, MAURIZIO, ARICO, MARIA BEATRICE, GALEOTTI,CESIRA, MASIGNANI,VEGA.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 28 de Febrero de 2001.

Clasificación PCT:

  • C07K14/22 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Neisseriaceae (F), p. ej. Acinetobacter.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.

PDF original: ES-2360746_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (por ejemplo, N. gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis).

Técnica antecedente

Las solicitudes de patente internacional WO99/24578, WO99/35544, WO99/57280 y WO00/22430 divulgan proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Estas proteínas se describen, de forma típica, expresadas en E. coli (es decir, una expresión heteróloga) como fusiones con GST N-terminales o como fusiones con marcador de His C-terminales, aunque también se describen otros sistemas de expresión, incluyendo la expresión en Neisseria nativa.

Gruiller et al., Biotecnología aplicada, 1996, vol. 13, nº 4, págs. 271-275 divulga una proteína de fusión de la proteína

P.1.15 de Neisseria con la proteína P64-K de Neisseria, y su expresión en E. coli.

Un objeto de la presente invención es proporcionar estrategias alternativas y mejoradas para la expresión heteróloga de estas proteínas. Estas estrategias afectan, de modo típico, al nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de la expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.

Divulgación de la invención

Según la invención, se expresan dos proteínas de la invención como una única proteína híbrida. Se prefiere no

utilizar un compañero de fusión que no provenga de Neisseria (por ejemplo, GST o poli-His). Esto ofrece dos ventajas. En primer lugar, una proteína que puede ser inestable, o que se expresa poco por sí sola, puede mejorarse añadiendo un compañero de hibridación adecuado que solucione el problema.

En segundo lugar, se simplifica la fabricación comercial, ya que sólo es necesario emplear una expresión y

purificación para producir dos proteínas útiles por separado. Así, la invención proporciona un procedimiento para la expresión heteróloga simultánea de dos proteínas de la invención, en el que dichas dos o más proteínas de la invención están fusionadas (es decir, se traducen como una sóla cadena polipeptídica).

El procedimiento incluirá de forma típica las etapas de obtener un primer ácido nucleico que codifique una primera proteína de la invención; obtener un segundo ácido nucleico que codifique una segunda proteína de la invención; ligar el primer y el segundo ácido nucleico. El ácido nucleico resultante puede insertarse en un vector de expresión, o puede ser ya parte de un vector de expresión.

La proteína híbrida puede representarse con la fórmula NH2-A-B-COOH. A comprende la proteína 287 y B comprende la proteína 961. 287 es su forma ΔG-287 con deleciones de poliglicina (ΔG). La proteína híbrida de la invención es ΔG287-961. 287 se usa en el extremo N-terminal como una forma ΔG de 287, como el extremo N-terminal de un híbrido con 961.

287 es preferentemente de la cepa 1996 o de la cepa 394/98. Pueden usarse las formas de dominios de 961. Las alineaciones de formas polimórficas de ORF46, 287, 919 y 953 se divulgan en el documento WO00/66741. Cualquiera de estos polimorfos puede usarse de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, las proteínas constituyentes (A y B) e una proteína híbrida de acuerdo con la invención vendrán de la misma cepa.

Las proteínas fusionadas en el híbrido están unidas directamente. Las proteínas fusionadas pueden carecer de los péptidos conductores nativos, o pueden incluir la secuencia peptídica conductora del compañero de fusión N-terminal

Huésped

Se prefiere utilizar un huésped heterólogo. El huésped heterólogo puede ser procariota o eucariota. Preferiblemente es E. coli, pero otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria

5 (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.

Secuencias

La invención también proporciona una proteína que comprende las secuencias de la secuencia SEQ ID NO 8.

El grado de "identidad de secuencia" es preferiblemente mayor que 70%. Esto incluye mutantes y variantes alélicas [por ejemplo, véase el documento WO00/66741]. La identidad se determina preferiblemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, ejecutado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), empleando una búsquedad de huecos afines con los parámetros penalización de hueco abierto = 12 y penalización de extensión de hueco = 1.

Las proteínas de la invención preferidas se encuentran en el serogrupo B de N. meningitidis.

Las proteínas de la invención preferidas son las del serogrupo B de la cepa 2996 o de la cepa 394/98 (una cepa de Nueva Zelanda) . A menos que se indique lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente proceden de la cepa 2996 de N. meningitidis. Sin embargo, se apreciará que la invención no está limitada, en general, por la cepa. Puede considerarse que las referencias a una proteína concreta (por ejemplo, “287”, “919”, etc.) incluyen esa proteína de cualquier cepa.

Breve descripción de los dibujos Las figuras 1 y 2 muestran las proteínas híbridas de acuerdo con la invención.

Modos de realizar la invención

Ejemplo 1 - Híbridos de G287

Se descubrió que la deleción de la secuencia (Gly)6 en 287 tiene un profundo efecto sobre la expresión proteica. La proteína que carece de los aminoácidos N-terminales hasta GGGGGG se denomina "G287". En la cepa MC58, su secuencia básica (el péptido conductor está subrayado) es:

**(Ver fórmula)**

La G287, con o sin un marcador de His ("G287-His" y "G287K", respectivamente) se expresa a niveles muy buenos, comparada con "287-His" o "287sin marcar".

Basándose en los datos de variabilidad genética, se expresaron variantes de -G287-His en E. coli de una serie de cepas MenB, en particular de las cepas 2996, MC58, 1000 y BZ232. Los resultados también fueron buenos; cada uno de ellos produjo altas valoraciones con ELISA y también unas valoraciones bactericidas séricas >8192. La G287K, expresada a partir de pET-24b, produjo excelentes valoraciones en el ensayo ELISA y bactericida sérico.

La G287 se fusionó directamente dentro de marco cadena arriba de 919 (las secuencias que aparecen a continuación):

**(Ver fórmula)**

ELISA Bactericida G287-961-His 108627 65536

Se prepararon las mismas proteínas híbridas utilizando la cepa 394/98 de Nueva Zelanda en lugar de 2996:

ΔG287NZ-961 Ejemplo 2 - Híbridos de 287

**(Ver fórmula)**

La expresión de 287, de longitud completa con un marcador de His C-terminal, o sin su péptido conductor pero con un marcador de His C-terminal, produce unos niveles de expresión bastante bajos. Se logró una mejor expresión empleando una fusión con GST N-terminal. Cuando se fusiona con la proteína 961 (la secuencia NH2-G287-961COOH mostrada anteriormente), la proteína resultante es insoluble y debe desnaturalizarse y renaturalizarse para la purificación. Después de la renaturalización, se descubrió que aproximadamente 50% de la proteína permanecía insoluble. Las proteínas soluble e insoluble se compararon, y se obtuvieron unas valoraciones bactericidas mucho

10 mejores con la proteína soluble (FCA como adyuvante):

2996 BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133 Soluble 65536 128 4096 >2048 >2048 4096 Insoluble 8192 <4 <4 16 n.d. n.d.

Sin embargo, las valoraciones con la forma insoluble mejoraron utilizando un adyuvante de alumbre:

Insoluble 32768 128 4096 >2048 >2048 2048

También se usó 961c en las proteínas híbridas (véase anteriormente). Puesto que 961 y sus variantes de dominio 5 dirigen una expresión eficaz, son idealmente adecuados como porción N-terminal de una proteína híbrida.

Detalles experimentales

Estrategia de clonación y diseño de oligonucleótidos

Los genes que codifican los antígenos de interés se amplificaron mediante PCR, utilizando... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína híbrida de fórmula NH2-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína G287 de Neisseria, y B comprende la proteína 961 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:8, o es una secuencia que tiene más de 70% de identidad de secuencia con ésta.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que G287 es de la cepa 2996 o 394/98 3. La proteína de la reivindicación 1, en la que 961 es de la cepa 2996 o 394/98. 4. La proteína de la reivindicación 1, en la que A y B son de la misma cepa. 5. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:8.


 

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