Expresión específica de tejido de proteínas exógenas en pollos transgénicos.

Un pollo modificado genéticamente que expresa de forma selectiva proteína exógena en células glandularestubulares,

en el que la proteína está codificada por un transgén mayor de 15 kb que está integrado de forma estableen un genoma del pollo y en el que el transgén comprende al menos una porción de un promotor de un gen quecodifica ovoalbúmina y en el que dicho promotor está unido operativamente al ADN que codifica la proteínaexógena.

Expresión específica de tejido de proteínas exógenas en pollos transgénicos

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la expresión de proteínas en animales transgénicos y quiméricos, y tecnologías que lo posibilitan tales como ingeniería genética, transgénicos y el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias. Las células madre embrionarias se someten a ingeniería genética con construcciones genéticas diseñadas especialmente para introducir modificaciones genéticas en aves, incluyendo la inserción de transgenes que dan expresión específica de tejido de proteínas exógenas. Las aves genéticamente modificadas de la invención expresan la proteína exógena derivada de transgén en el oviducto y la proteína se deposita en grandes cantidades en el huevo.

Antecedentes de la invención Los animales modificados genéticamente ofrecen el potencial de tremendos avances en la producción de valiosos productos farmacéuticos en las células de dichos animales. No obstante, la producción de animales modificados genéticamente implica obstáculos técnicos significativos que solo se han superado para algunas especies. La capacidad de incorporar modificaciones genéticas en el ADN permanente de una especie requiere varias tecnologías distintas que se deben desarrollar para cada especie modificada genéticamente. Un abordaje para alterar las características genéticas y físicas de un animal es usar células madre embrionarias que contribuyen al fenotipo de un animal cuando se inyectan en una forma embrionaria del animal. Las células madre embrionarias tienen la capacidad de contribuir al tejido de un animal nacido a partir del embrión receptor y de contribuir al genoma de un organismo transgénico creado mediante cruces de quimeras.

Se ha comprometido un significativo gasto de tiempo y recursos al estudio y desarrollo de líneas de células madre embrionarias, la manipulación del genoma de las células y las técnicas de cultivo celular que permiten que dichas células sometidas a ingeniería se mantengan en cultivo. Aunque se han realizado muchos intentos, la capacidad para mantener la pluripotencia de las células madre embrionarias sometidas a ingeniería en cultivo solo se ha conseguido para algunas especies, principalmente ratones. Para otras especies, la promesa de ingeniería genética en transgénicos para la producción de proteínas se ha frustrado por la ausencia de cultivos prolongados de células madre embrionarias sostenibles.

Si hubiera fácilmente disponibles cultivos sostenibles de células madre embrionarias y fueran sensibles a ingeniería genética al tiempo que mantienen su pluripotencia, dispondríamos de una amplia aplicación de nuevas tecnologías. Dado que las células madre embrionarias contribuyen al ADN permanente de un animal, las características fisiológicas del animal del que deriva la célula madre embrionaria se pueden transferir a un embrión receptor incorporando estas células en el animal receptor en estado embrionario. Esto ofrece dos ventajas principales: primera, el fenotipo de un animal del que derivan las células madre embrionarias se puede transferir selectivamente a un embrión receptor. Segunda, como se ha indicado anteriormente, cuando los cultivos de células madre embrionarias son particularmente estables, el genoma de las células se puede modificar genéticamente para introducir modificaciones genéticas en un embrión receptor en el que se introducen las células.

En determinados casos, las células madre embrionarias se pueden someter a ingeniería con un transgén que codifica una proteína exógena. El transgén es una construcción genética que contiene ADN que actúa como el plan de acción para la producción de una proteína valiosa y contiene suficiente codificación y elementos reguladores para permitir la expresión de la proteína en el tejido del animal que se crea a partir de la inserción de las células madre en un embrión receptor. En muchos casos, a expresión de una proteína es particularmente valiosa porque la proteína se puede recoger y aislar del animal transgénico. No obstante, la recolección de una proteína valiosa de los tejidos de un animal normalmente requiere que la expresión se limite a determinados tejidos específicos que facilitan la recolección de la proteína expresada. Por ejemplo, en vacas, la expresión de una proteína en la leche permitiría la fácil recolección de la proteína simplemente recogiendo la leche de la vaca y separando la proteína exógena. En pollos, la producción sólida de proteínas en la clara del huevo también proporciona un vehículo atractivo para la 55 expresión de proteínas exógenas. Si la expresión de proteínas valiosas se pudo conseguir de este modo, el animal se pudo usar como vehículo para la producción de proteínas que es superior a otros procedimientos de producción. Por tanto, un campo de investigación particularmente atractivo y un área atractiva para el desarrollo comercial es el de los animales modificados genéticamente que expresan determinadas proteínas exógenas en tejidos específicos que facilitan el aislamiento y la recolección de la proteína. La capacidad para producir proteínas exógenas en células seleccionadas específicamente de un animal es también particularmente valiosa porque la ausencia de especificidad de tejido simplemente da lugar a la expresión de la proteína en todos los tejidos de un animal. En estas circunstancias, es improbable que una cantidad significativa de la proteína se pueda separar del animal y, además, la expresión ubicua de una proteína exógena suele ser muy dañina para la salud general y el bienestar del animal.

Si un cultivo de células madre embrionarias es suficientemente estable como para permitir que un transgén se integre en el genoma de la célula madre embrionaria, un transgén que codifica la expresión específica de tejido de una proteína se puede pasar a un organismo nuevo quimérico o transgénico mediante varias técnicas diferentes en función de la construcción específica usada como transgén. Los genomas enteros se pueden transferir mediante hibridación celular, los cromosomas intactos mediante microcélulas, los segmentos subcromosómicos mediante transferencia génica mediada por cromosoma, y los fragmentos de ADN en el intervalo de kilobases mediante 5 transferencia génica mediada por ADN (Klobutcher, L.A. y F.H. Ruddle, Annu. Rev. Biochem., 50: 533-554, 1981) . Los cromosomas intactos se pueden transferir a una célula madre embrionaria mediante transferencia cromosómica mediada por microcélulas (TCMM) (Fournier, R.E. y F.H. Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: 319-323, 1977) . El diseño específico del transgén también debe considerar el contenido de las secuencias de ADN que codifican la proteína exógena, el tejido específico al que se ha dirigido la expresión, el organismo huésped en el que se produce la expresión y la naturaleza de la proteína que se va a expresar. Dado que las proteínas que normalmente se expresan in vivo varían espectacularmente en lo que respecta a su tamaño, las características bioquímicas y la funcionalidad, el transgén diseñado para expresión específica de tejido debe satisfacer varios parámetros para permitir el éxito de la integración en el genoma de una célula madre embrionaria y para garantizar el éxito de la expresión en el tejido seleccionado del organismo huésped.

Como se ha indicado anteriormente, el rendimiento de las modificaciones genéticas en las células madre embrionarias para producir animales transgénicos únicamente se ha demostrado en muy pocas especies. Para ratones, se conoce bien el uso por separado de recombinación homóloga seguida de transferencia cromosómica a células madre embrionarias (ME) para la producción de descendencia quimérica y transgénica. Se han desarrollado potentes técnicas de recombinación homóloga específica de sitio o direccionamiento génico (véanse Thomas, K. R. y M.R. Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987; revisión por Waldman, A.S., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 12: 49-64, 1992) . La inserción del ADN clonado (Jakobovits, A., Curr. Biol. 4: 761-763, 1994) , y la manipulación y selección de fragmentos de cromosomas mediante las técnicas del sistema Cre-loxP (véanse Smith, A. J. y cols., Nat. Genet. 9: 376-385, 1995; Ramirez-Solis, R. y cols., Nature 378: 720-724, 1995; patentes de EE.UU. 4.959.317; 6.130.364;

6.091.001; 5.985.614) están disponibles para la manipulación y transferencia de genes a células ME murinas para producir quimeras genéticas estables. Muchas de estas técnicas cuya utilidad se ha demostrado en sistemas de mamíferos estarían disponibles para su aplicación a células madre embrionarias no mamíferas si se dispusiera de los cultivos... [Seguir leyendo]

1. Un pollo modificado genéticamente que expresa de forma selectiva proteína exógena en células glandulares tubulares, en el que la proteína está codificada por un transgén mayor de 15 kb que está integrado de forma estable en un genoma del pollo y en el que el transgén comprende al menos una porción de un promotor de un gen que codifica ovoalbúmina y en el que dicho promotor está unido operativamente al ADN que codifica la proteína exógena.

2. El pollo modificado genéticamente de la reivindicación 1, que además comprende al menos una segunda porción de un promotor de un gen que codifica ovoalbúmina que flanquea al extremo 3’ del ADN que codifica la proteína exógena.

3. El pollo modificado genéticamente de la reivindicación 1, en el que la proteína exógena es un anticuerpo monoclonal 15

4. El pollo modificado genéticamente de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal está compuesto por una cadena pesada humana.

5. El pollo modificado genéticamente de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo monoclonal es de isotipo IgG. 20

6. Un huevo de pollo que contiene proteína humana producida por el pollo modificado genéticamente de la reivindicación 1, en el que la proteína humana se produce mediante expresión específica de tejido en células glandulares tubulares del oviducto del pollo modificado genéticamente y en el que la proteína humana está codificada por un transgén integrado de forma estable en el genoma del pollo y en el que el transgén contiene el

ADN exógeno que codifica la proteína.

7. El huevo de la reivindicación 6, en el que la proteína humana es un anticuerpo monoclonal.