Estructura cristalina del receptor de la hormona estimuladora del tiroides.

Un cristal que comprende un polipéptido de TSHR que incluye los aminoácidos 22-260 procedentes delpolipéptido de TSHR.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2007/003286.

Solicitante: RSR LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: AVENUE PARK PENTWYN CARDIFF CF23 8HE REINO UNIDO.

Inventor/es: SANDERS, JANE, FURMANIAK, JADWIGA, REES SMITH,BERNARD.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen hasta 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados (gastrinas A61K 38/16, somatostatinas A61K 38/31, melanotropinas A61K 38/34).
  • C07K14/72 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › para hormonas.

PDF original: ES-2426925_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Estructura cristalina del receptor de la hormona estimuladora del tiroides Campo de la invención La presente invención se refiere al receptor de la tirotropina, conocido también como receptor de la hormona estimuladora del tiroides, (TSHR) y a autoanticuerpos reactivos con el TSHR, y en particular, las interacciones entre el TSHR y dichos autoanticuerpos tal como se ha determinado mediante cristalografía de rayos X.

Antecedente La tirotropina u hormona estimuladora del tiroides (TSH) es una hormona pituitaria que regula la función del tiroides mediante el TSHR (Szkudlinski MW, Fremont V, Ronin C, Weintraub 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure-function relationships. Physiological Reviews 82: 473-502) . La unión de TSH con el TSHR estimula la señalización del receptor que conduce a la estimulación de la formación y a la liberación de hormonas tiroideas: Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) , Un mecanismo de retroalimentación que implica los niveles de T4 y T3 en la circulación y la hormona liberadora de tirotropina (TRH) secretada por el hipotálamo controla la liberación de la TSH, que a su vez controla la estimulación del tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en suero.

El TSHR es un receptor acoplado a la proteína G y tiene tres dominios: -un dominio rico en leucina (LRD) , un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Núñez Miguel R, Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Blundell TL, Rees Smith B, Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropin interaction by comparative modeling. Thyroid 14: 991-1011) . El TSHR muestra similitudes de aminoácidos y estructurales con los otros receptores de hormonas de glicoproteínas, es decir, el receptor de la hormona luteneizante (LHR) y el receptor de la hormona estimuladora del folículo (FSHR) . La estructura del FSHR encomplejo con su ligando (es decir, la FSH) se ha resuelto a una resolución de 2, 9 Å (Fan QR, Hendrickson WA 2005 Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor. Nature 433: 269-277) .

Se encuentra bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad tiroidea autoinmune (AITD) , que es la enfermedad autoinmune más común que afecta a diferentes poblaciones a nivel mundial, tienen autoanticuerpos reactivos con el TSHR (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121) . En la mayoría de los casos, estos autoanticuerpos se unen al TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de esta forma al tiroides a producir niveles elevados de T4 y T3. Estos autoanticuerpos se describen como autoanticuerpos estimuladores del tiroides o autoanticuerpos de TSHR (TRAb) con actividad estimuladora de la actividad agonista de la TSH. El mecanismo de retroalimentación que controla usualmente la función del tiroides ha dejado de ser eficaz en presencia de los autoanticuerpos estimuladores del tiroides, y los pacientes presentan síntomas de tiroides hiperactivo (exceso de hormonas tiroideas en suero) . Esta dolencia es conocida como tirotoxicosis o enfermedad de Graves. En algunos pacientes, se piensa que los TRAb con actividad estimuladora interactúan con los TSHR en tejidos retroorbitales y contribuyen a producir los síntomas oculares de la enfermedad de Graves.

En algunos pacientes con AITD, los autoanticuerpos se unen al TSHR, evitando la unión de la TSH con el receptor, pero no tienen capacidad para estimular la actividad de TSHR; estos tipos de autoanticuerpos se conocen como TRAb, con actividad bloqueante, o actividad antagonista de la TSH.

Los autoanticuerpos de TSHR, cuando están presentes en el suero de una mujer embarazada en elevadas concentraciones pueden cruzar la placenta y pueden producir tirotoxicosis neonatal (en el caso de autoanticuerpos estimuladores) o hipotiroidismo neonatal (en el caso de autoanticuerpos bloqueantes) (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 más arriba) .

Un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un poderoso estimulador del tiroides (hMAb TSHR1) se ha desarrollado en detalle en la Solicitud de Patente Internacional WO2004/050708A2. Se ha encontrado que el sitio de unión para el TSHR1 del hMAb está localizado sobre la superficie del dominio rico en leucina de TSHR (LRD) y solapa extensamente con el sitio de unión de la TSH. Sin embargo, el bolsillo de unión en el TSHR y el TSHR1 del hMAb es conformacional e implica regiones discontinuas en el plegado conjunto de TSHR. La caracterización detallada del sitio de unión para el TSHR1 del hMAb, en particular los aminoácidos en contacto importantes en la interacción entre el TSHR y el TSHR1 del hMAb, es de importancia fundamental en los estudios que intentan mejorar el diagnóstico y la gestión de las enfermedades asociadas con una respuesta autoinmune al TSHR. La solicitud de patente internacional WO 2006/016121A da a conocer una preparación de TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que se puede utilizar en el cribado e identificación diferencial de los autoanticuerpos de TSHR estimuladores en el suero de un paciente, autoanticuerpos del suero de un paciente que bloquean el TSHR y hormona estimuladora del tiroides en una muestra de fluido corporal procedente de un paciente que se está cribando. La invención descrita en la solicitud de patente internacional con número WO2006/016121A proporciona información útil con respecto a las regiones de TSHR que son importantes en la interacción con diversos anticuerpos que incluyen TSHR1 del hMAb, un anticuerpo monoclonal de ratón (9D33) con actividad bloqueante de TSHR y con TSH. Sin embargo, los detalles de las interacciones entre los aminoácidos de TSHR y los aminoácidos de TSHR1 del hMAb al nivel atómico no se podrían derivar ni siquiera de los mejores estudios experimentales, tales como los descritos en el documento WO2006/016121A, que implican la mutación de TSHR.

La presente invención se basa en la preparación de un complejo formado por un fragmento de LRD de TSHR (que está implicado en la formación del bolsillo de unión para el TSH y el TSHR1 del hMAb) y el fragmento Fab de TSHR1 del hMAb. Las preparaciones de TSHR1 del hMAb descritas en esta memoria se denominan M22 por conveniencia. La IgG de M22 se puede adquirir de RSR Ltd. El fragmento de TSHR que cubre los aminoácidos 1-260 (TSHR260) en complejo con el fragmento Fab de TSHR1 del hMAb (M22) se denomina TSHR260-M22. Un complejo de TSHR260-M22 se purificó, se concentró y se cristalizó. Se utilizaron los datos de difracción de rayos X para resolver la estructura de TSHR260 tal como se describe en la presente invención. Se había descrito anteriormente que sehabía resuelto la estructura de Fab de M22 con una resolución de 1, 65 Å (Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Kiddie A, Brereton K, Premawardhana LDKE, Chirgadze DY, Núñez Miguel R, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor: sequence structure and function. Thyroid 14: 560-570) . Se ha comparado la estructura de M22 en el complejo con la de M22 sin unir. A continuación se refinaron las interacciones entre TSRH260 y M22 a nivel atómico.

Hasta la fecha, no han estado disponibles preparaciones de TSHR muy purificadas con su actividad de unión a TSH y TRAb intacta. Las preparaciones de TSHR purificadas descritas en la técnica se han desnaturalizado en parte y no son suficientemente puras u homogéneas para la cristalización.

Resumen de la invención De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un cristal que comprende un polipéptido de TSHR, que incluye los aminoácidos 22-260 procedentes del polipéptido de TSHR.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un co-cristal que comprende un polipéptido de TSHR que incluye los aminoácidos 22-260 procedentes del polipéptido de TSHR, y una entidad de unión a TSHR, en la que la entidad de unión a TSHR es un anticuerpo dirigido contra TSHR o una porción del mismo.

El polipéptido de TSHR comprende preferiblemente una secuencia de TSHR de mamífero. Preferiblemente, la secuencia de mamífero es de origen humano, pero se contempla también el uso de secuencias de chimpancé, de canino, felino, porcino, bovino o cobaya. Preferiblemente, el polipéptido de TSHR incluye al menos una porción del dominio rico en leucina de TSHR de mamífero, lo más preferible, una secuencia humana. Preferiblemente, el polipéptido de TSHR incluye los aminoácidos 22-60 de la secuencia de TSHR humano de tipo silvestre o los aminoácidos correspondientes procedentes de otras secuencias de TSRH de mamíferos. El polipéptido de TSHR en un complejo de acuerdo con la invención puede comprender la secuencia de tipo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un cristal que comprende un polipéptido de TSHR que incluye los aminoácido.

2. 260 procedentes del polipéptido de TSHR.

2. Un co-cristal que comprende un polipéptido de TSHR de acuerdo con la reivindicación 1 y una entidad de unión al TSHR, en el que la entidad de unión al TSHR es un anticuerpo dirigido contra el TSHR o una de sus porciones.

3. Un cristal de acuerdo con la reivindicación 1 o un co-cristal de acuerdo con la reivindicación 2 en el que el polipéptido de TSHR incluye al menos los aminoácido.

2. 260 del dominio rico en leucina de un TSHR de mamífero.

4. Un cristal de acuerdo a la reivindicación 1 o un co-cristal de acuerdo con la reivindicación 2 en que el polipéptido de TSHR tiene una secuencia de ser humano, chimpancé, porcino, bovino, canino, felino o cobaya.

5. Un cristal de acuerdo con la reivindicación 1, 3 o 4 o un co-cristal de acuerdo con la reivindicación 2, 3 o 4 en que el polipéptido de TSHR incluye los aminoácido.

2. 260 de la secuencia humana de tipo silvestre o los aminoácidos correspondientes de otras secuencias de TSHR de mamíferos.

6. Un co-cristal de acuerdo con la reivindicación 2, 3, 4 o 5 o en que el anticuerpo es un autoanticuerpo o una porción del mismo o derivada del anterior.

7. Un co-cristal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que comprende una forma cristalina del polipéptido del TSRH que tiene las coordenadas que se muestran en la Figura 9a o la Figura 9b.

8. Un medio de almacenamiento de datos legible mediante máquina que codifica datos que se refieren al menos a una porción, preferiblemente todas las coordenadas de los aminoácidos del polipéptido del TSRH de la Figura 9a o la Figura 9b o uno de sus homólogos, en que el homólogo tiene una raíz cuadrada de la desviación media de losátomos de la estructura de entre 0 Å y 4 Å

9. Un sistema informatizado para presentar una representación de una estructura tridimensional de un polipéptido de TSHR, o un homólogo de un polipéptido de TSHR de este tipo, en que el homólogo tiene una raíz cuadrada de ladesviación media de los átomos de la estructura de entre 0 Å y 4 Å, incluyendo el sistema informatizado medios de almacenamiento de datos que incluyen datos que corresponden a coordenadas de los aminoácidos del polipéptido de TSHR de la Figura 9a o la Figura 9b, y, opcionalmente, medios de almacenamiento de datos que incluyen datos que corresponden a coordenadas de un anticuerpo que interactúa con el polipéptido de TSHR o un homólogo del mismo.

10. Un sistema informatizado de acuerdo con la reivindicación 9 dispuesto para proporcionar una representación de una estructura tridimensional del polipéptido de TSHR o de un homólogo del mismo que interactúa con un anticuerpo

o una porción del mismo.

11. Un procedimiento para identificar un ligando que va a interactuar con el TSHR, comprendiendo el procedimiento identificar un ligando que va a interactuar con al menos un aminoácido de la estructura tridimensional de un polipéptido de TSHR o un homólogo del mismo de acuerdo con una representación proporcionada por un sistema informatizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 en el que se identifica un ligando que va a interactuar formando un enlace de hidrógeno con al menos uno de los aminoácidos de TSHR: K129, E107, K58 e Y185; o se identifica un ligando que va a interactuar formando interacciones de van der Waals con al menos uno de los restos de aminoácidos de TSHR R255, R80, K129, R38 y K183; o se identifica un ligando que va a interactuar formando interacciones electrostáticas con al menos uno de los restos de aminoácidos de TSHR D151, K58, K129, R80, K209 y K183; o se identifica un ligando que va a interactuar formando interacciones de pares iónicos con el resto de aminoácido K209 de TSHR.

13. Un procedimiento para identificar un ligando que va a interferir con la unión de autoanticuerpos con el TSHR, tal como autoanticuerpos estimuladores del tiroides o antagonistas de la TSH, comprendiendo el procedimiento identificar un ligando que interactúa con la arista muy positivamente cargada del extremo N-terminal de la superficie cóncava del dominio rico en leucina de TSHR.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 en el que se identifica un ligando que interactúa con al menos uno de los siguientes aminoácidos de TSHR: R38, K58, R80, H105 y K129.

15. Un procedimiento para identificar un ligando que va a interferir con la unión de autoanticuerpos con el TSHR, tal como autoanticuerpos estimuladores del tiroides o antagonistas de la TSH, comprendiendo el procedimiento identificar un ligando que rellena una cavidad negativamente cargada sobre la superficie de M22 formada por M22 H1, H2 y H3 utilizando un sistema informatizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, comprendiendo el procedimiento identificar un ligando que va a romper la unión de un autoanticuerpo estimulador del tiroides con el resto R255 de TSHR; o un ligando que va a romper una unión de un autoanticuerpo estimulador del tiroides con el aminoácido K209 de TSHR humano.

17. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que el ligando identificado interactúa con el receptor de la hormona estimuladora del folículo y/o el receptor de la hormona luteneizante.


 

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