Enzimas lisantes de la pared celular estables a proteasas.

Polipéptido según SEC ID Nº: 1.

Enzimas lisantes de la pared celular estables a proteasas La presente invención se refiere a un polipéptido modificado según SEC ID Nº: 1. La invención se refiere además a ácidos nucleicos con una secuencia que codifica los polipéptidos según la invención.

Las bacterias patógenas aparecen en muchos sitios y causan enormes problemas para la salud por infecciones, así como altos costes económicos, por ejemplo, también por invasión por bacterias no deseada en las industrias alimentaria, cosmética o medioambiental. En la sanidad, los problemas aumentan cada vez más debido a gérmenes resistentes a antibióticos, de manera que se buscan desesperadamente alternativas a los antibióticos. En las industrias alimentaria y cosmética se intenta cada vez más salir adelante sin los clásicos conservantes que cada vez tienen menos aceptación en la población. Como solución a estos problemas se ofrece la utilización de enzimas lisantes de la pared celular que previenen naturalmente el crecimiento de bacterias no deseadas y destruyen gérmenes existentes.

Ejemplos de enzimas lisantes de la pared celular son endolisinas, que se aislaron de bacteriófagos. Los bacteriófagos utilizan estas enzimas al final de su ciclo de propagación para liberar los bacteriófagos formados dentro de la célula bacteriana. Con ello, la envoltura bacteriana se lisa y de esta manera se destruye la bacteria huésped. Otro ejemplo son enzimas que necesita el bacteriófago al principio de su ciclo de propagación y generalmente están localizadas en proteínas de la cola de bacteriófagos. Estas enzimas se necesitan para la rotura de la pared bacteriana en la infección bacteriana. Un tercer ejemplo son enzimas que presentan una función similar y frecuentemente también una similitud secuencial con las endolisinas. Estas enzimas son las autolisinas formadas por bacterias bajo determinadas circunstancias que conducen a la autolisis de bacterias. Un cuarto ejemplo son enzimas que también son formadas por bacterias y se conocen como bacteriocinas. Estos cuatro grupos de enzimas lisantes de la pared celular ya se utilizan técnicamente y en el futuro probablemente ganarán importancia.

Un campo de aplicación es la utilización médica en la prevención y terapia, así como el diagnóstico de infecciones bacterianas en el ser humano y animales. Otro campo de aplicación es la aplicación en las industrias alimentaria, medioambiental y cosmética para evitar un crecimiento bacteriano no deseado y para destruir gérmenes, por ejemplo, por desinfección, así como la detección de bacterias en muestras alimentarias, medioambientales y cosméticas.

Prácticamente todas las aplicaciones en las que se usan enzimas lisantes de bacterias exigen altos requisitos a la estabilidad de las enzimas utilizadas, para que su utilización merezca la pena económicamente. En el documento US 6.432.444 B1 se propone usar para la estabilización de las enzimas lisantes de la pared celular, por ejemplo, un tampón estabilizador para garantizar la actividad enzimática óptima. Además, se propone la adición de sustancias estabilizadoras como agentes reductores, quelantes de metales, inmunoglobulinas, sales tampón específicas, valores de pH fisiológicos, conservantes o detergentes suaves.

Generalmente, la estabilidad de las proteínas se reduce frecuentemente debido a proteasas existentes. Las estrategias para elevar la estabilidad de proteínas a una degradación por proteasas son, por ejemplo, la adición de quelantes de metales para inhibir proteasas que para su actividad necesitan iones metálicos o la adición de inhibidores de proteasas especiales como pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, para serina proteasas. Sin embargo, los inhibidores de proteasas sólo pueden utilizarse con limitaciones para la estabilidad de enzimas lisantes de la pared celular porque también alteran otros componentes esenciales en el sitio de acción. Además, los inhibidores específicos también son muy caros. Tampoco es generalmente posible la selección de otras condiciones medioambientales en las que las proteasas sean menos activas, ya que las enzimas lisantes de la pared celular necesitan condiciones muy similares para su actividad como las proteasas. Así, las enzimas lisantes de la pared celular trabajan mejor en un entorno acuoso y bajo valores de pH moderados, bajo los cuales la actividad de proteasas también es la mayor. Los enfoques de estabilización conocidos no son adecuados para la utilización en enzimas lisantes de la pared celular.

Por tanto, el objetivo de la presente invención consiste en proporcionar enzimas lisantes de la pared celular estables.

El objetivo se alcanza mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras sirven para explicar la invención.

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos natural del dominio CHAP (aminoácidos 1-154) , la región de ligador (subrayada, aminoácidos 155-193) y el dominio amidasa (aminoácidos 194-393) de una endolisina de PlyPitti26. Posibles sitios de escisión para V8 proteasa, que se escinde después del residuo de aminoácido E, están marcados en negrita y se encuentran en las posiciones de aminoácidos 163, 179 y 189. El sitio de escisión de trombina está resaltado en gris y se encuentra en la posición R167.

La Figura 2 muestra el resultado de una digestión con proteasas y posterior prueba de actividad de PlyPitti26 no modificada con las proteasas trombina y V8 proteasa. La Figura 2A muestra un gel de SDS-poliacrilamida con muestras de PlyPitti26 no modificada después de una digestión con trombina (T) , V8 proteasa (V8) y una digestión 2 5

de control con plasmina (P) , para la que no existe sitio de escisión. PlyPitti26 sin digerir está marcada con “-”. M designa patrones de peso molecular con los tamaños de proteínas especificados en el borde en kDa. En el borde derecho están especificadas las posiciones de las bandas para el fragmento del extremo N del sitio de escisión de trombina (dominios CHAP) , el fragmento del extremo C del sitio de escisión (Ami-CBD) y las bandas de trombina añadida. La Figura 2B muestra el resultado de una prueba de lisis de líquidos para determinar las actividades específicas de PlyPitti26 no modificada digerida y no digerida. La lisis de células bacterianas se sigue mediante una medición de dispersión de la luz en el fotómetro. Están representadas las curvas de lisis para PlyPitti26 sin digerir (__) , endolisina digerida con plasmina (-----) , así como digerida con trombina (_._.) o V8 proteasa (_.._..) .

La Figura 3 muestra el resultado de una digestión con proteasas de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada y no modificada. La Figura 3A muestra el resultado de una digestión con trombina de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3) . CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada posee un sitio de escisión de trombina singular entre el dominio CHAP y amidasa en la posición R167, el polipéptido modificado un intercambio de R con A en la posición 167. La Figura 3A muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de la digestión con trombina: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa especificados en el borde) ; 1 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada sin trombina; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada después de la digestión con trombina; 3 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin trombina; 4 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada después de la adición de trombina.

La Figura 3B muestra el resultado de una digestión con V8 proteasa de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3) . CHAPAmiPitti26-CBDUSA no modificada posee un sitio de escisión de V8 proteasa entre el dominio CHAP y amidasa en la posición E163, el polipéptido modificado un intercambio de E a A en la posición 163. La Figura 3B muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de digestión con V8-proteasa: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa especificados en el borde) ; 1 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada sin V8 proteasa; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 15 min digestión con V8 proteasa; 3 -CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 60 min digestión con V8 proteasa; 4 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin V8 proteasa; 5 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada 15 min digestión con V8 proteasa; 6 - CHAPAmiPitti26-CBDUSA modificada 60 min digestión con V8 proteasa.

La Figura 4 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de la endolisina modificada del fago de Cl. difficile c CD119 (CD119) con la endolisina modificada del fago... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido según SEC ID Nº: 1.

2. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2.

4. Célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 o un vector de expresión según la reivindicación 3.

5. Polipéptido según la reivindicación 1 como fármaco.

6. Polipéptido según la reivindicación 1 para su uso como fármaco para la prevención o terapia de infecciones por

bacterias Gram-positivas, especialmente clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc.

7. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 para inhibir el crecimiento de bacterias Gram-positivas en las industrias medioambiental, alimentaria o cosmética.

8. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 ex vivo como medio de diagnóstico en medicina, las industrias 15 medioambiental, alimentaria o cosmética.

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