Enzima lipolítica fúngica en la que la enzima comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en la SEC.

ID. nº 1 o la SEC. ID. nº 2 o la SEC. ID. nº 4 o la SEC. ID. nº 6, o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de identidad con la SEC. ID. nº 1, SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4 o SEC. ID. nº 6, y en la que la presenta una proporción superior de actividad sobre los lípidos polares en comparación con los triglicéridos

Enzimas lipolíticas fúngicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas enzimas lipolíticas fúngicas y a uno o más polinucleótidos que codifican una o más enzimas lipolíticas fúngicas nuevas. La invención se refiere además a procedimientos de producción de enzimas lipolíticas fúngicas y a sus utilizaciones. La presente invención se refiere además a la preparación de una sustancia alimenticia mejorada, en particular a la preparación de productos de panadería mejorados. Específicamente, la invención proporciona nuevas enzimas lipolíticas fúngicas, enzimas que pueden proporcionar características mejoradas a los productos alimenticios, incluyendo los productos de panadería.

Antecedentes de la técnica

La utilización beneficiosa de las enzimas lipolíticas (E.C.3.1.1.x) en aplicaciones industriales de alimentación y/o piensos se ha conocido hace muchos años.

Por ejemplo, en la patente EP 0 585 988 se reivindica que la adición de lipasa a la masa producía una mejora en el efecto antiendurecimiento. Se sugiere que cuando se añade a la masa una lipasa obtenida a partir de Rhizopus arrhizus puede mejorar la calidad del pan resultante cuando se utiliza en combinación con manteca/grasa. El documento WO 94/04035 da a conocer que puede obtenerse una blandura mejorada en el pan añadiendo una lipasa a la masa sin adición de ninguna grasa o aceite adicional a la masa. Castello, P. ESEGP 89-10 de dic. de 1999, Helsinki, demuestra que las lipasas exógenas pueden modificar el volumen del pan.

El sustrato para las lipasas en la harina de trigo es el 1,5 al 3% de lípidos de trigo endógenos, que son una mezcla compleja de lípidos polares y apolares. Los lípidos polares pueden dividirse en glucolípidos y fosfolípidos. Estos lípidos están constituidos por glicerol esterificado con dos ácidos grasos y un grupo polar. El grupo polar contribuye a la actividad en superficie de estos lípidos. La escisión enzimática de uno de los ácidos grasos en estos lípidos conduce a lípidos con una actividad superficial mucho mayor. Es bien sabido que los emulsionantes, tales como DATEM, con gran actividad superficial son muy funcionales cuando se añaden a la masa.

Las enzimas lipolíticas hidrolizan uno o más de los ácidos grasos procedentes de los lípidos presentes en el alimento lo que puede producir la formación de moléculas de emulsionantes potentes dentro de la sustancia alimenticia lo que proporciona funcionalidad comercialmente valiosa. Las moléculas que contribuyen a la mayoría de las características del emulsionante significativas, son los productos de la hidrólisis parcial, tales como, moléculas de lisofosfolípidos, lisoglucolípidos y de monoglicéridos. Los productos de la hidrólisis de lípidos polares, a saber lisofosfolípidos y lisoglucolípidos, son particularmente ventajosos, en la elaboración del pan, dichos emulsionantes derivados in situ pueden proporcionar funcionalidad equivalente como emulsionantes añadidos, tal como DATEM.

Sin embargo, se ha descubierto que además la actividad de las enzimas lipolíticas produce acumulación de ácidos grasos libres, lo que puede conducir a funcionalidad perjudicial en la sustancia alimenticia. Esta actividad propia de las enzimas lipolíticas limita su funcionalidad.

El efecto negativo sobre el volumen del pan, se explica con frecuencia por sobredosis. La sobredosis puede conducir a una disminución en la elasticidad del gluten, lo que produce una miga que es demasiado rígida y de este modo produce volúmenes reducidos. Además, o alternativamente, dichas lipasas pueden degradar la manteca, el aceite o la grasa de leche añadidos a la masa, causando una pérdida de sabor en la masa y el producto horneado. La sobredosis y la falta de sabor se han atribuido a la acumulación de ácidos grasos libres en la masa, particularmente los ácidos grasos de cadena corta.

La presencia de grandes concentraciones de ácidos grasos libres (FFA) en las materias primas o los productos alimenticios es generalmente reconocida como un defecto de calidad y los procesadores de alimentos y clientes incluirán normalmente una concentración de FFA máxima en las especificaciones de alimentos. Los efectos resultantes de las concentraciones en exceso de FFA pueden estar en los defectos organolépticos y/o funcionales.

En la patente EP 1 193 314, se descubrió que la utilización de enzimas lipolíticas activas sobre glucolípidos era particularmente beneficiosa en las aplicaciones en la elaboración del pan, ya que los lisoglucolípidos productos de la hidrólisis parcial se descubrió que presentan una funcionalidad del emulsionante muy alta, dando como resultado aparentemente una producción superior a la funcionalidad positiva del emulsionante en comparación con la acumulación perjudicial de ácidos grasos libres. Sin embargo, se descubrió que las enzimas también tienen actividad no selectiva significativa sobre los triglicéridos, lo que da como resultado ácidos grasos libres innecesariamente elevados.

Este problema de gran actividad de triglicéridos fue estudiado en el documento WO 02/094123, en el que se descubrió que seleccionando enzimas lipolíticas que eran activas sobre los lípidos polares (glucolípidos y fosfolípidos en una masa) pero sustancialmente inactivas sobre los triglicéridos o los 1-monoglicéridos, podía conseguirse una funcionalidad mejorada.

Una fuente comercialmente preferida de enzimas lipasa, son los hongos filamentosos tales como Aspergillus spp. y Fusarium spp. Se ha descubierto que las lipasas aisladas de los hongos filamentosos tienen características industrialmente aplicables y además se ha descubierto que son una rutina que se expresa en sistemas de producción heterólogos, tales como en Aspergillus oryzae, Fusarium y levadura.

Una lipasa procedente de Fusarium oxysporum se identificó en la patente EP 0 130 064, y la aplicación de las lipasas de F. oxysporum en aplicaciones alimentarias se ha sido sugerida en Hoshino et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664.

La patente EP 0 869 167 describe la clonación y expresión de una lipasa de Fusarium oxysporum y su utilización en la cocción. Está descrito que la enzima presenta actividad de fosfolipasa. Esta enzima está comercializada actualmente por Novozymes A/S (Dinamarca) como Lipopan F^TM.

El documento WO 02/00852 da a conocer cinco enzimas lipasa y sus polinucleótidos codificadores, aisladas de F.venenatutum, F. sulphureum, A. berkeleyanum, F. culmorum y F. solani. Se describe que las cinco enzimas presentan actividad hidrolizante de triacilglicerol, actividad de fosfolipasa y de galactolipasa. Tres de las enzimas presentan actividad equivalente a la de la enzima F. oxysporum dada a conocer en la patente EP 0 869 167: F. venenatutum, F. sulphureum y F. culmorum.

Por consiguiente, es evidente que algunas lipasas de Fusarium, incluyendo Lipopan F^TM, se ha descubierto que tienen actividad secundaria sobre los lípidos polares, incluyendo los fosfolípidos y los glucolípidos. Aunque descrita como una fosfolipasa en la patente EP 0 869 167, la lipasa procedente de Fusarium oxysporum presenta gran actividad de lipasa. La enzima además presenta actividad de glucolipasa. Sin embargo, a pesar de la significativa actividad sobre los lípidos polares, la funcionalidad conseguida mediante la utilización de la enzima es limitada debido a la gran actividad de lipasa (es decir, de triglicérido).

Nagao et al. (J. Biochem 116 (1994) 536-540) describen una lipasa procedente de F. heterosporum; enzima que funciona predominantemente como una lipasa (E.C.3.1.1.3) para hidrolizar triglicéridos. Esto es muy diferente de las enzimas según la presente invención.

Se han producido variantes de enzima lipolítica, con sustituciones y fusiones de aminoácidos específicos, algunas de las cuales tienen una actividad aumentada sobre los lípidos polares en comparación con las enzimas originales naturales. El documento WO 01/39602 describe dicha variante, mencionada como SP979, que es una fusión de la lipasa de Thermomyces lanuginosus y la lipasa de Fusarium oxysporum descrita en la patente EP 0 869 167. Esta variante se ha descubierto que tiene una proporción significativamente alta de actividad sobre fosfolípidos y...

1. Enzima lipolítica fúngica en la que la enzima comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en la SEC. ID. nº 1 o la SEC. ID. nº 2 o la SEC. ID. nº 4 o la SEC. ID. nº 6, o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de identidad con la SEC. ID. nº 1, SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4 o SEC. ID. nº 6, y en la que la presenta una proporción superior de actividad sobre los lípidos polares en comparación con los triglicéridos.

2. Secuencia nucleotídica que codifica una enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1.

3. Ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica, siendo dicho ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por:

a) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº 3 o la SEC. ID. nº 5 o la SEC. ID. nº 7;

b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia nucleotídica de la SEC. ID. nº 3 o la SEC. ID. nº 5 o la SEC. ID. nº 7 por degeneración del código genético; y

c) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº 3 o la SEC. ID. nº 5 o la SEC. ID. nº 7.

4. Procedimiento de preparación de una sustancia alimenticia que comprende añadir la enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1 a uno o más ingredientes de la sustancia alimenticia.

5. Procedimiento de preparación de un producto horneado que comprende la adición de una enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1 a una masa y hornear la masa para preparar el producto horneado.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la sustancia alimenticia es uno o más de entre los siguientes: huevo o un producto a base de huevo; un producto horneado; producto de pastelería; un producto congelado; un producto lácteo, que incluye un queso; una mousse; una crema vegetal batida; un aceite y una grasa comestibles; un producto batido aireado y no aireado; emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite; margarina; manteca; un producto para untar, incluyendo productos para untar bajos en grasa y muy bajos en grasa; un aliño; mayonesa; una salsa para mojar; una salsa a base de crema; una sopa a base de crema; una bebida, una emulsión de especias y una salsa.

7. Procedimiento de preparación de un lisofosfolípido que comprende tratar un fosfolípido con la enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1 para producir el lisofosfolípido.

8. Procedimiento de preparación de un lisoglucolípido que comprende tratar un glucolípido con una enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1 para producir un lisoglucolípido.

9. Procedimiento de desengomado enzimático de aceites vegetales o comestibles, que comprende el tratamiento del aceite comestible o vegetal con una enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1 con el fin de hidrolizar una mayor parte de los lípidos polares presentes en los mismos.

10. Composición para mejorar el pan o composición para mejorar la masa que comprende la enzima lipolítica fúngica según la reivindicación 1.

11. Composición para mejorar el pan o composición para mejorar la masa según la reivindicación 10 que comprende una exo- o endoamilasa.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en el que la enzima lipolítica fúngica se utiliza en combinación con una alfa-amilasa.