Enzimas de ARN polimerasa propensas a la formación de caperuza y sus aplicaciones.

Enzima híbrida que comprende:

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN trifosfatasa,



- por lo menos un dominio catalítico procedente de una guanililtransferasa,

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una N7 guanina-metiltransferasa, y

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente de ADN.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/056051.

Solicitante: EUKARYS.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 5, rue Maidstone Centre d'Affaires le Coryphée Bâtiment Alto -BP 455 60004 Beauvais Cedex FRANCIA.

Inventor/es: JAIS,PHILIPPE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/43 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Enzimas; Proenzimas; Sus derivados.
  • C12N15/62 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12N9/12 C12N 9/00 […] › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
  • C12N9/14 C12N 9/00 […] › Hidrolasas (3.).

PDF original: ES-2436356_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Enzimas de ARN polimerasa propensas a la formación de caperuza y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere al campo de la transgenia, especialmente en las células eucariotas.

En especial, la invención se refiere a una enzima híbrida útil para la producción de moléculas de ARN con estructuras con caperuza (en inglés "cap") m7GpppN en el terminal 5'.

La expresión eucariótica se utiliza ampliamente en las ciencias biológicas, la biotecnología y la medicina. Por lo tanto, se han desarrollado muchos métodos para la transgenia eficiente en las células eucariotas. Fuentes de ADN comunes y mecanismos para administración son los virus (por ejemplo, baculovirus, retrovirus, o adenovirus) o vectores no víricos, incluyendo plásmidos y cromosomas artificiales.

Debido a su sencillez, los plásmidos no víricos se utilizan generalmente como vectores de expresión para la transferencia génica en células eucariotas, tanto en aplicaciones in vitro como in vivo. Sin embargo, los niveles de expresión transgénica conseguida por procedimientos no víricos suelen ser modestos y disminuyen rápidamente. Una explicación frecuente de esta modesta eficacia es el hecho de que las moléculas de ADN, que son de más de aproximadamente 40.000 daltons, son demasiado grandes para atravesar los poros nucleares y entrar en el núcleo, donde son transcritos por la ARN polimerasa II nuclear (Lang, Scholz et al. 1986; Zabner, Fasbender et al. 1995) . De hecho, sólo una cantidad muy pequeña (<0, 1-0, 001%) de grandes moléculas de ADN se transfiere activamente desde el citoplasma al núcleo de las células eucariotas. Los mecanismos por los cuales la expresión disminuye rápidamente son también posiblemente nucleares específicos y relacionados con el silenciamiento de la expresión transgénica por diversos mecanismos epigenéticos (Loser, Jennings et al. 1998;. Gill, Smyth et al. 2001;. Miao, Thompson et al. 2001; Nicol, Wong et al. 2002;. Miao, Ye et al. 2003) .

Otros inconvenientes de los métodos de transgenia que utilizan el sistema de transcripción de ARN endógeno de las células eucariotas también restringen su uso. En primer lugar, la poca capacidad de procesamiento de las ARN polimerasas eucariotas nucleares (por ejemplo, 10-20 nucleótidos/segundo para la ARN polimerasa II) (Fire, Samuels et al., 1984;. Ucker y Yamamoto, 1984; Bengal, Flores et al. 1991;. Izban y Luse 1992) . En segundo lugar, la competencia entre la transcripción de genes endógenos y la transcripción de transgenes. En tercer lugar, la extrema complejidad de las ARN polimerasas eucariotas, que están formadas por varias subunidades (por ejemplo, 12 subunidades de ARN polimerasa II y reguladas por múltiples factores de transcripción (Lodish, Berk et al. 2008) .

En vista de estos inconvenientes, se han desarrollado algunos métodos de transgenia basados en ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico. Estos métodos tienen en especial la ventaja de no utilizar el sistema de transcripción de ARN endógeno de las células eucariotas, excepto algunas ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico, que tienen una capacidad de procesamiento mayor que las ARN polimerasas eucariotas.

El sistema de expresión de pET es un método popular para la expresión génica en procariotas (Studier, Rosenberg et al. 1990) . Se basa en la expresión de la ARN polimerasa dependiente de la única subunidad T7 ADN de bacteriófago (T7 ARN polimerasa, T7ARNP) , el producto del gen 1 de T7, para transcribir los genes de interés modificados genéticamente para ser expresados bajo el control de un activador T7. El sistema de expresión pET se ha adaptado a las células eucariotas y por lo general se denomina ARN polimerasa híbrida. Sin embargo, en un medio eucariótico, la alta actividad enzimática de la ARN polimerasa dependiente de T7 ADN contrasta notablemente con rendimientos muy débiles de traducción de los transcritos de T7 (Fuerst, Niles et al. 1986) . La ausencia de maduración de los transcritos en células eucariotas, que no son ni modificados por la adición de estructuras con caperuza en su extremo 5' (Benton, Eng et al. 1990; Dower y Rosbash 2002) , ni muy poliadenilados en su extremo 3' (Mifflin y Kellems 1991; Dower y Rosbash 2002) , proporciona una explicación de esta discrepancia.

Se han desarrollado por lo tanto procedimientos para mejorar la capacidad de traducción de transcritos sin caperuza producidos por el sistema híbrido, como el sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP de bacteriófago. Este sistema de expresión eucariota se basa en un virus vacunal recombinante que sintetiza la ARN polimerasa dependiente de T7 ADN bacteriofágico en el citoplasma de células de mamíferos infectadas (Fuerst, Niles et al. 1986;. Fuerst, Earl et al. 1987;. Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Fuerst, Fernández et al. 1989;. Fuerst y Moss 1989; Elroy-Stein y Moss 1990) . El gen diana para la ARN polimerasa bacteriofágica, flanqueado por el activador T7 y secuencias de terminación, se introduce en las células infectadas, ya sea por transfección de un plásmido recombinante o por infección con un segundo virus vacunal recombinante (Fuerst, Niles et al. 1986;. Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein y Moss 1990) . Era de esperar que las enzimas citoplásmicas codificadas por el virus vacunal para la caperuza (en inglés "capping") del ARNm actuarían en los transcritos de T7 para mejorar su capacidad de traducción. Sin embargo, la caperuza de transcritos de T7 permanece por debajo de la óptima (Fuerst y Moss 1989) . Por ejemplo, utilizando este sistema de expresión, se descubrió que los transcritos de T7 pueden comprender hasta el 30% de todo el ARN citoplásmico tras un período de 24 horas, pero sólo el 5% -10% de las estructuras con caperuza en el terminal 5' contenidas en transcritos de T7 (Fuerst y Moss 1989) . Aunque bastante eficaz, los inconvenientes técnicos del sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP bacteriofágico restringen claramente su generalización y utilización a gran escala. En primer lugar, este sistema se basa en los virus de las

vacunas recombinantes, que son infecciosos para los seres humanos. Por lo tanto, la manipulación de estos virus recombinantes requiere instalaciones y prácticas de laboratorio específicas. Una cepa aviar atenuada anfitriona de espectro restringido, es decir, la Ankara de la vacuna modificada (MVA) , que interrumpe su ciclo de replicación en una etapa de envasado en fase tardía en las células humanas, se puede utilizar para controlar mejor este riesgo (Wyatt, Moss et al. 1995; Engleka, Lewis et al. 1998) . En segundo lugar, la vacuna recombinante o los virus MVA son citotóxicos. Por lo tanto, el sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP de bacteriófago sólo se puede utilizar para la transgenia transitoria (Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein y Moss 1990) . En tercer lugar, el sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP de bacteriófago puede utilizarse fácilmente en algunos modelos celulares que son permisivos a la infección por la vacuna (por ejemplo, BSC-1) , mientras que algunos no lo son (por ejemplo, CHO) . La inserción del gen CP77 del virus de la viruela en el genoma del virus vacunal recombinante puede superar la restricción del espectro del anfitrión del sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP bacteriofágico de las células de ovario de hámster chino (CHO) al permitir que el virus de la vacuna infecte de manera productiva estas células (Spehner, Gillard et al. 1988;. Ramsey-Ewing y Moss 1996) . En cuarto lugar, debido a la complejidad del sistema, cabe esperar una variabilidad significativa en su eficacia, incluso en el mismo modelo celular. En quinto lugar, el sistema de expresión híbrido virus de la vacunal/ARNP bacteriofágico es una tecnología costosa y laboriosa que por lo tanto es poco apropiada para ensayos a gran escala y producción de proteínas.

En un intento de acoplar la caperuza a la transcripción y por lo tanto para mejorar la capacidad de traducción de transcritos sin caperuza producidos por la T7 ARN polimerasa, esta enzima se ha fusionado con el dominio del terminal carboxilo (DTC) de la subunidad mayor de la ARN polimerasa II (POLR2A) , (Natalizio, Robson-Dixon et al. 2009) . El DTC comprende 25 a 52 repeticiones de heptapéptido de la secuencia consenso 1YSPTSPS7, que está muy conservada en toda la evolución y está sometida a la fosforilación reversible durante el ciclo de la transcripción (Palancade y Bensaude 2003) . Cuando está fosforilada, se cree que el DTC actúa como mediador en el acoplamiento de la transcripción y caperuza de las transcripciones nacientes, por unión a una o más subunidades de las enzimas de caperuza del ARNm en levaduras (Cho, Takagi et al. 1997;... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Enzima híbrida que comprende:

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN trifosfatasa,

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una guanililtransferasa,

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una N7 guanina-metiltransferasa, y

- por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente de ADN.

2. Enzima híbrida según la reivindicación 1, caracterizada porque es una enzima híbrida citoplásmica.

3. Enzima híbrida según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente del ADN de bacteriófago.

4. Enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que por lo menos uno de dichos dominios catalíticos seleccionado de entre el grupo constituido por:

- dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa;

- dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y

- dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa;

es un dominio catalítico procedente de una enzima que forma caperuza para virus.

5. Molécula aislada de ácido nucleico o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico, codificando dicha (s) molécula (s) de ácido nucleico una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, que está unida funcionalmente por lo menos a un activador seleccionado de entre el grupo constituido por:

- el activador para la ARN polimerasa II; y

- el activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.

7. Vector, que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 o 6.

8. Célula anfitriona que comprende una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la reivindicación 5 o 6 o un vector según la reivindicación 7.

9. Organismo eucariota no humano genéticamente modificado, que expresa una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Utilización in vitro o ex vivo de una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la producción de la molécula de ARN con una caperuza m7GpppN en el terminal 5'.

11. Procedimiento in vitro o ex vivo para la producción de una molécula de ARN con una caperuza m7GpppN en el terminal 5' codificada por una secuencia de ADN, en una célula anfitriona, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de expresar en la célula anfitriona una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la reivindicación 5 o 6, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida al activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho procedimiento comprende además la etapa de inhibir la expresión de por lo menos una de las subunidades de la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o de la enzima endógena que forma caperuza en dicha célula anfitriona.

13. Kit para la producción de una molécula de ARN con caperuza m7GpppN en el terminal 5', que comprende por lo menos una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una molécula de ácido nucleico aislado y/o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico según la reivindicación 5 o 6, y/o un vector según la reivindicación

7.

14. Composición farmacéutica que comprende una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una molécula aislada de ácido nucleico y/o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico según la reivindicación 5

o 6 y/o un vector según la reivindicación 7.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, que comprende además:

- por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida al activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.


 

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