Ensayos de actividad de endopeptidasa re-dirigida basados en inmunología.

Un método para detectar actividad endopeptidasa redirigida, comprendiendo el método las etapas de:

a. tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una endopeptidasa redirigida, en elque la célula de una línea celular establecida es susceptible a la actividad endopeptidasa redirigida por una endopeptidasaredirigida;

b. aislar de la célula tratada un componente SNAP-25 (proteína asociada a sinaptosoma 25) que comprende un productode escisión de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de escisión deBoNT/A (toxina botulínica de serotipo A);

c. poner en contacto al componente SNAP-25 con un anticuerpo α-SNAP-25 enlazado a un soporte de fase sólida, en elque el anticuerpo α-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlaceescindible del sitio de escisión de BoNT/A de un producto de escisión de SNAP-25; y

d. detectar la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno que comprende el anticuerpo α-SNAP-25 y el producto deescisión de SNAP-25;

en el que la detección por el complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de actividad endopeptidasa redirigida;en el que el anticuerpo α-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlaceescindible del sitio de escisión de BoNT/A de un producto de escisión de SNAP-25;

en el que el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia deaminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:79 o SEQ ID NO: 81, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 71, la SEQID NO: 75, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 79 o la SEQ ID NO: 81;

y en el que el anticuerpo α-SNAP-25 tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia deaminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO:91, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 87, la SEQID NO: 89 o la SEQ ID NO: 91

Ensayos de actividad de endopeptidasa redirigida basados en inmunología.

Las secuencias desveladas en la presente memoria descriptiva figuran en el listado de secuencia presentado como parte de la presente memoria descriptiva.

La capacidad de toxinas clostridiales, tales como: por ejemplo, Neurotoxinas botulínicas (BoNT) , BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G y neurotoxina tetánica (TeNT) , para inhibir la transmisión neuronal están siendo explotadas en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase por ejemplo, William J. Lipham, Cosmetic and Clincal Appplications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004) . Las toxinas clostridiales disponibles en el mercado como composiciones farmacéuticas incluyen, preparaciones de BoNT/A, tales como, por ejemplo, BOTOX ® (Allergan, Inc., Irvine, CA) , DYSPORT®/RELOXIN® (Ipsen Ltd., Slough, Inglaterra) , PURTOX® (Mentor Corp., Santa Barbara, CA) , XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Francfort, Alemania) , NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) , BTX-A (Biogen-tech Ltd., University, Yantai, Shandong, China) ; y preparaciones de BoNT/B, como, por ejemplo, MYOBLOC®/NEUROBLOC® (Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, CA) . Como ejemplo, BOTOX ® está aprobado actualmente en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad adulta, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor esencial, líneas del entrecejo o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas nasolabiales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno del nervio VII.

Un tratamiento de toxina de Clostridium inhibe neurotransmisores y la liberación de neuropéptidos interrumpiendo el proceso exocitótico utilizado para segregar los neurotransmisores y neuropéptidos en la hendidura sináptica. Existe un gran deseo por la industria farmacéutica de ampliar la utilización de toxinas clostridiales terapias más allá de sus aplicaciones actuales miorrelajante para tratar una dolencia basada en los nervios sensoriales, tales como, por ejemplo, diversos tipos de dolor crónico, inflamación neurogénica y trastornos urogenitales, así como otros trastornos, tales como, por ejemplo, la pancreatitis. Un enfoque que actualmente está siendo explotado para ampliar terapias basadas en toxinas clostridiales implica la modificación de una toxina de Clostridium, de modo que la toxina modificada tenga una capacidad de dirigirse a una célula alterada para una célula neuronal o no-neuronal de interés. Llamado endopeptidasa redirigida o Proteínas Moduladoras de Exocitosis Vesicular Dirigida (TVEMP) , estas moléculas alcanzan sus efectos inhibidores de exocitosis utilizando un receptor diana presente en la célula diana neuronal o no neuronal de interés. Esta capacidad redirigida se consigue mediante la sustitución de un dominio de unión de origen natural de una toxina de Clostridium por un dominio director que muestra una actividad de unión selectiva para un receptor de toxina no Clostridial presente en una célula diana neuronal o no neuronal de interés. Tales modificaciones de un dominio de unión dan como resultado una molécula que es capaz de unirse selectivamente a un receptor de toxina clostridial presente en la célula diana. Una endopeptidasa redirigida puede unirse a un receptor diana, translocarse en el citoplasma y ejercer su efecto proteolítico sobre el complejo SNARE de la célula diana neuronal o no neuronal de interés.

Un grupo de endopeptidasa redirigida comprende moléculas que tienen un dominio de dirección a opiáceos. Estas endopeptidasas redirigidas a opiáceos comprenden un dominio de dirección a opiáceos, un dominio de translocación de toxinas clostridiales y un dominio enzimático de la toxina Clostridial. Se describen ejemplos no limitantes de endopeptidasa redirigida a opiáceos u opiáceo-TVEMP, por ejemplo, en los documentos Keith A. Foster y col., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensor y Afferent Functions, Patente de los E.E.U.U. 5.989.545; J. Oliver Dolly y col., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente de los E.E.U.U. 7.132.259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente de los E.E.U.U. 7.244.437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente de los E.E.U.U. 7.413.742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente de los E.E.U.U. 7.415.338; Lance E. Steward y col., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Patente de los E.E.U.U. 7.514.088; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de los E.E.U.U. 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de los E.E.U.U. 2009/0035822; Lance E. Steward y col., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, , publicación de patente de los E.E.U.U. 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, publicación de patente de los E.E.U.U 2009US/0162341; Keith A. Foster y col., Re-targeted Toxin Conjugates, Publicación internacional de patente WO 2005/023309; y Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, , solicitud de patente WO 2008/008805. El documento WO 96/33273 A1 menciona un anticuerpo que reconoce el producto de la proteólisis del SNAP-25 por la cadena L de BoNT/A y reconoce el recién revelado extremo carboxi del SNAP-25 escindido y menciona la utilización del anticuerpo en un transferencia de Western de muestras de células PC-12 incubadas con 10 mg/ml de un conjugado de NGF y LHN (Ejemplo 2) . El documento U.S. 2004/0219619 A1 menciona un "anticuerpo anti-SNAP25197 (Zymed #1 antisuero) que sólo reconoce el producto SNAP25 escindido" (Ejemplo 9) .

Una diferencia general entre endopeptidasas redirigidas y toxinas clostridiales es que dado que las endopeptidasas redirigidas típicamente no se dirigen a las neuronas motoras, la letalidad asociada con la sobredosis de un mamífero con una endopeptidasa redirigida se minimiza, si no se evita completamente. Por ejemplo, endopeptidasas redirigidas a opiáceos pueden ser administradas a 10.000 veces la dosis terapéuticamente eficaz antes de que se observe evidencia de letalidad, y esta letalidad es debida a la difusión pasiva de la molécula y no a través del proceso de intoxicación. Por lo tanto, para todos los propósitos prácticos, las endopeptidasas redirigidas son moléculas no letales. Aunque esta propiedad no letal es de gran beneficio terapéutico, surge un problema de fabricación porque el ensayo de actividad estándar utilizado para la fabricación de productos biológicos basados en la toxina Clostridium es un bioensayo DL50 en ratón, una prueba de letalidad. S. S. Arnon y col., JAMA 285: 1059-1070 (2001) . Actualmente un bioensayo DL50 en ratón es utilizado por todos los fabricantes de productos farmacéuticos para expresar la potencia de sus preparaciones de toxinas clostridiales. De hecho, las unidades de actividad de las toxinas clostridiales son unidades de DL50 en ratón. Sin embargo, dado que las endopeptidasas redirigidas son esencialmente no-letales, no puede utilizarse un bioensayo DL50 en ratón para evaluar la potencia de estas moléculas. Así, un ensayo de actividad sencillo, fiable, validado y aceptable por la agencia gubernamental que pueda evaluar la integridad de todas las etapas necesarias en la absorción de endopeptidasa redirigida sería de gran valor.

La presente memoria descriptiva proporciona nuevas composiciones, células y métodos para evaluar la actividad de las endopeptidasas redirigidas útiles para diversas industrias, tales como: por ejemplo, la industria farmacéutica y alimentaria y proporciona ventajas relacionadas. Estas composiciones, células y métodos no utilizan animales vivos o tejidos de animales vivos, pero pueden evaluar todas las etapas necesarias para la acción de endopeptidasa redirigida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un diagrama esquemático del actual paradigma de la liberación de neurotransmisores e intoxicación por toxina de Clostridium en una neurona central y periférica. La figura 1A muestra un diagrama esquemático para el mecanismo de liberación del neurotransmisor de una neurona central y periférica. El proceso de liberación puede ser descrito como comprendiendo dos etapas: 1) acoplamiento vesicular, donde la proteína SNARE unida a vesícula de una vesícula que contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con las proteínas SNARE unidas a membrana localizadas... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar actividad endopeptidasa redirigida, comprendiendo el método las etapas de:

a. tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una endopeptidasa redirigida, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible a la actividad endopeptidasa redirigida por una endopeptidasa redirigida;

b. aislar de la célula tratada un componente SNAP-25 (proteína asociada a sinaptosoma 25) que comprende un producto de escisión de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de escisión de BoNT/A (toxina botulínica de serotipo A) ;

c. poner en contacto al componente SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 enlazado a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de escisión de BoNT/A de un producto de escisión de SNAP-25; y

d. detectar la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de escisión de SNAP-25;

en el que la detección por el complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de actividad endopeptidasa redirigida; en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de escisión de BoNT/A de un producto de escisión de SNAP-25;

en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 o SEQ ID NO: 81, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 79 o la SEQ ID NO: 81;

y en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 91, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 89 o la SEQ ID NO: 91.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 72, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 82; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 90 y la SEQ ID NO: 92.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el producto de escisión de SNAP-25 es SNAP-25197.

4. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno se detecta utilizando un ELISA en sándwich.

5. Un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de escisión de BoNT/A de un producto de escisión de SNAP-25;

en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 o SEQ ID NO: 81, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 79 o la SEQ ID NO: 81;

y en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 91, o una secuencia de ácido nucleico que es, como mínimo, el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 89 o la SEQ ID NO: 91.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 72, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 82; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 90 y la SEQ ID NO: 92.

7. El anticuerpo de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el producto de escisión de SNAP-25 es SNAP-25197. 5

8. El anticuerpo o método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo producido por el hibridoma ID3B8, teniendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84.

9. El anticuerpo o método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo producido por el hibridoma 2E2A6, teniendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88.

10. El anticuerpo o método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo producido por el hibridoma 3C1A5, teniendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90.

11. El anticuerpo o método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo producido por el hibridoma 3C3E2, teniendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 o la SEQ ID NO: 82 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92.