ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.

Un método de ensayo para la determinación de la presencia o la cantidad de un fármaco inmunosupresor en una muestra que incluye los pasos de proporcionar la muestra;

mezclar dicha muestra con un primer receptor y un segundo receptor para formar una suspensión, donde dichos primer y segundo receptores están unidos a partículas de detección y cada uno de dichos primer y segundo receptores se une específicamente a un sitio de unión separado en dicho fármaco, donde en presencia del fármaco se da como resultado la aglutinación de las partículas de detección; detectar o medir directamente la cantidad de aglutinación de partículas en dicha suspensión; y correlacionar la cantidad de aglutinación de partículas con la presencia o la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/006200.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: DORN, ALLAN, R., SIGLER, GERALD, F., GHOSHAL,MITALI, TSAI,JANE,S.,C, RASHID,Shaker, WU,Yifei.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 12 de Julio de 2007.

Clasificación PCT:

  • G01N33/543 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos.
  • G01N33/94 G01N 33/00 […] › en los que intervienen narcóticos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2359587_T3.pdf

 

Ilustración 1 de ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.
Ilustración 2 de ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.
Ilustración 3 de ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.
Ilustración 4 de ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.
Ilustración 5 de ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.
ENSAYO DE AGLUTINACIÓN HOMOGÉNEO DE DOBLE RECEPTOR PARA FÁRMACOS INMUNOSUPRESORES.

Fragmento de la descripción:

Campo de la invención 5

La presente invención pertenece al campo de la monitorización terapéutica de fármacos, y en particular, a los méto-dos de inmunoensayo para la determinación de la presencia o la cantidad de sustancias farmacológicas inmunosu-presoras en una muestra. Más particularmente, la presente invención está relacionada con ensayos de doble recep-tor homogéneos no competitivos para la medición de fármacos inmunosupresores. 10

Antecedentes

Varios fármacos inmunosupresores importantes actúan sobre las inmunofilinas, la ciclosporina, el tacrolimus, la ra-pamicina, y el everolimus. Las inmunofilinas son proteínas chaperonas con actividad isomerasa de peptidil-prolil que 15 pertenecen a una de las dos grandes familias, las ciclofilinas de unión a ciclosporina (CyPs) y las proteínas de unión a FK506 (FKBPs).

La ciclosporina (también conocida como ciclosporina A) es un metabolito natural de un hongo del suelo, un péptido compuesto por 11 aminoácidos y, junto al tacrolimus, es un inhibidor de la calcineurina. Se cree que la ciclosporina 20 se une a la proteína citosólica ciclofilina (una inmunofilina) de los linfocitos inmunocompetentes, especialmente linfo-citos T. Este complejo de ciclosporina y ciclofilina inhibe a la calcineurina, que bajo circunstancias normales induce la transcripción de interleucina-2. El fármaco también inhibe la producción de linfocina y la libración de interleucina, dando lugar a una función reducida de las células T efectoras.

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El tacrolimus (FK506) también es un producto fúngico (Streptomyces tsukubaensis). Es una lactona macrolítica y actúa inhibiendo la calcineurina. El fármaco se utiliza particularmente en los transplantes de hígado, riñón, corazón y pulmón. Se une a una inmunofilina, seguido de la unión del complejo a la calcineurina y la inhibición de su actividad fosfatasa. De este modo, previene el paso de fase G0 a fase G1. El tacrolimus es más potente que la ciclosporina y tiene efectos secundarios menos prominentes. 30

La rapamicina (sirolimus) es un fármaco inmunosupresor extremadamente potente. Forma un complejo estable con FKBP12 (una proteína de unión a FK506 de 12-kDa), y a su vez el complejo rapamicina-FKBP12 se une a la diana en mamíferos de la rapamicina (mTOR) o a la diana en levaduras de la rapamicina (yTOR). Existen dos formas de yTOR, yTOR1 e yTOR2. Como miembro de la novedosa familia de quinasas relacionadas con la fosfatidilinositol 35 quinasa, la actividad quinasa de las mTORs es esencial para su función de señalización. El dominio de unión de rapamicina FKBP12 (FRBD) en mTOR ha sido identificado como un segmento de 11 kDa localizado en posición N-terminal en relación al dominio quinasa. Aunque la ciclosporina y el tacrolimus (FK506) tienen estructuras molecula-res diferentes, sus propiedades inmunosupresoras y mecanismos moleculares son similares. Ambos fármacos se unen intracelularmente con abundantes proteínas citosólicas conocidas como inmunofilinas. En el caso del tacroli-40 mus, parece ser que la mayor proteína de unión es FKBP12, mientras que la ciclosporina se une a la familia de in-munofilinas llamadas ciclofilinas. Estos complejos fármaco-inmunofilina pueden después formar un complejo pen-tamérico con calcineurina, calmodulina, y calcio causando una inhibición no competitiva de la actividad fosfatasa de la calcineurina.

45

El everolimus es un macrólido inmunosupresor que posee una cadena estable de 2-hidroxietilo en posición C-40 de la estructura del sirolimus. El everolimus, que tiene una mayor polaridad que el sirolimus, fue desarrollado en un intento de mejorar las características farmacocinéticas del sirolimus.

La calcineurina (CaN), una proteína fosfatasa heterodimérica, está compuesta por una subunidad catalítica A de 61 50 kDa (CaNA) y una subunidad reguladora B de 19 kDa (CaNB). Se conoce que el efecto inhibitorio del tacrolimus (FK506) en la actividad enzimática de CaN está mediado en gran parte por FKBP12. El hecho que el complejo FK506/FKBP12 se une a CaN con alta afinidad en presencia de calcio hace que sea posible el desarrollo de un en-sayo en sándwich de doble receptor para medir cuantitativamente el tacrolimus en las muestras de sangre.

55

Desde que los análisis de estructura cristalina revelaron que tanto CaN A como B aportan interfases de interacción para la unión al complejo FK506-FKBP12, la fusión deseada debe incluir estas dos subunidades. Recientemente se ha descrito la expresión y la purificación de un polipéptido de cadena simple de 97 kDa de una fusión de calcineurina A/B-calmodulina (scCN) (Y. Qin et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1747, 171-178, 2005). Aunque era implícito que la cadena simple de CaN-CaM puede presentar actividad fosfatasa, la capacidad para unirse al complejo FK506-60 FKBP12 aún no se ha determinado. Además, el nivel de expresión de esta scCN de 97 kDa fue bastante pobre. En un intento de producir una proteína más pequeña y de más fácil manipulación, Schreiber y colaboradores describie-ron la generación de fusiones de CaN truncada. En una de dichas fusiones, los aminoácidos 12-394 de la CaNA fueron fusionados en el extremo N-terminal de la CaNB completa a fin de expresar una CAB funcional (fCAB). De un modo similar, también se construyó una versión más corta llamada CAB mínima (mCAB) que contenía los aminoáci-65 dos 340-394 de la CaNA y la CaNB completa. La actividad de unión de estas fCAB y SCAB al complejo FK506-

FKBP12 se indicó mediante los ensayos de marcador transcripcional en las células T Jurkat transfectadas tempo-ralmente (P. Clemons et al, Chemistry & Biology, 9, 49-61, 2002). No obstante, desde entonces no se han descrito más estudios en relación a la expresión y la purificación de fCAB y mCAB para determinar directamente la interac-ción con FK506-FKBP12 in vitro.

5

Para el adecuado manejo de los pacientes transplantados en terapia con fármacos inmunosupresores es importante obtener concentraciones sanguíneas de fármaco óptimas. Dado que a menudo los fármacos inmunosupresores se dan en combinación entre sí, la especificidad por el fármaco original es crítica.

Se conocen, y están disponibles comercialmente, varios inmunoensayos competitivos para fármacos inmunosupre-10 sores en los que un conjugado de un análogo del fármaco compite con el fármaco libre por un número limitado de sitios de unión a anticuerpos. Aunque estos inmunoensayos muestran buena selectividad por los fármacos origina-les, generalmente muestran reactividad cruzada significativa a uno o más metabolitos, dando lugar por consiguiente a un sesgo positivo indeseable en los inmunoensayos cuando se comparan con los métodos de referencia. Los en-sayos actuales para fármacos inmunosupresores también incluyen una cromatografía líquida de alta eficacia acopla-15 da a una espectrometría de masas (LC/MS/MS). Estas metodologías requieren equipos y habilidades especiales.

Con los inmunoensayos competitivos de, por ejemplo, rapamicina se observa un problema adicional, ya que se re-quiere la utilización de un derivado análogo de la rapamicina, el cual es inherentemente inestable. Otro problema que aparece con los inmunoensayos competitivos es la dificultad de lograr una sensibilidad suficiente para medir 20 rangos terapéuticos muy bajos, por ejemplo, de 5-20 ng/ml.

Se ha demostrado un acoplamiento covalente directo de la proteína de unión a las partículas en el formato de ensa-yo del fármaco inmunosupresor de receptor único para la detección de rapamicina en las patentes co-pendientes comúnmente denominadas US 60/714,712, archivada el 7 de septiembre de 2005, y US 11/468,940 archivada el 31 25 de agosto de 2006, el contenido de cuyas aplicaciones está incorporado aquí como referencia. La utilización de na-nopartículas también se describe en éstas.

Armstrong et al., en Clinical Chemistry 44:12, 2516-2523 (1998) describen un ensayo de formación de pentámeros para la medición de tacrolimus y sus metabolitos activos tras su extracción a partir de sangre total. Ellos describen 30 un ensayo basado en placas microtituladas utilizando proteínas de unión.

Sagi-Eisenberg, en la patente WO 2005/062708 publicada el... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de ensayo para la determinación de la presencia o la cantidad de un fármaco inmunosupresor en una muestra que incluye los pasos de proporcionar la muestra; mezclar dicha muestra con un primer receptor y un segundo receptor para formar una suspensión, donde dichos primer y segundo receptores están unidos a 5 partículas de detección y cada uno de dichos primer y segundo receptores se une específicamente a un sitio de unión separado en dicho fármaco, donde en presencia del fármaco se da como resultado la aglutinación de las partículas de detección; detectar o medir directamente la cantidad de aglutinación de partículas en dicha sus-pensión; y correlacionar la cantidad de aglutinación de partículas con la presencia o la cantidad del fármaco in-munosupresor en la muestra. 10

2. El método de la reivindicación 1, en el que el fármaco inmunosupresor se selecciona de entre el grupo que con-siste en ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, y everolimus, y dicho primer receptor es una inmunofilina o un fragmento de unión de la misma.

15

3. El método de la reivindicación 1, en el que las partículas de detección se seleccionan de entre el grupo que consiste en micropartículas y nanocápsulas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el fármaco inmunosupresor es rapamicina o everolimus; el primer receptor contiene una proteína de unión a FK506 (FKBP); y el segundo receptor contiene una proteína diana de 20 la rapamicina (TOR).

5. El método de la reivindicación 1, en el que el fármaco inmunosupresor es tacrolimus; el primer receptor contiene una proteína de unión a FK506 (FKBP); y el segundo receptor contiene calcineurina o un fragmento de unión de la misma. 25

6. El método de la reivindicación 1, en el que el fármaco inmunosupresor es ciclosporina; el primer receptor con-tiene una ciclofilina; y el segundo receptor contiene calcineurina.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la calcineurina tiene unida tanto la calmodulina como el ion de calcio. 30

8. El método de la reivindicación 3, en el que la muestra es una muestra de sangre obtenida de un paciente al que se ha administrado al menos un fármaco inmunosupresor.

9. Un reactivo para la determinación de un fármaco inmunosupresor en una muestra, conteniendo dicho reactivo 35 un primer complejo de unión al fármaco que contiene un primer receptor unido a una primera partícula de detec-ción; un segundo complejo de unión al fármaco que contiene una porción de unión seleccionada de entre el grupo que consiste en un segundo receptor unido a una partícula de detección, un anticuerpo específico para el fármaco inmunosupresor unido a una segunda partícula de detección, y un anticuerpo específico para el segun-do receptor unido a una segunda partícula de detección que está formando un complejo con un segundo recep-40 tor, donde cada complejo de unión al fármaco se une específicamente a un sitio de unión separado en dicho fármaco inmunosupresor.

10. El reactivo de la reivindicación 9, en el que la porción de unión es un segundo receptor unido a una partícula de detección. 45

11. Un método para la determinación de la presencia o la cantidad de un fármaco inmunosupresor en una muestra que incluye los pasos de: proporcionar una muestra; mezclar dicha muestra con un receptor unido a una prime-ra partícula de detección y una porción de unión que se selecciona de entre el grupo que consiste en un anti-cuerpo específico para el fármaco inmunosupresor unido a una segunda partícula de detección, un anticuerpo 50 específico para el segundo receptor unido a un receptor que está formando un complejo con un segundo recep-tor para formar una suspensión, donde dicho receptor se une específicamente a dicho fármaco en un sitio dife-rente al que se une el anticuerpo específico para el fármaco inmunosupresor, donde en presencia del fármaco se da como resultado la aglutinación de las partículas de detección; medir una cantidad de aglutinación de partículas en dicha suspensión mediante medición de la absorbancia; y correlacionar la cantidad de aglutinación 55 de partículas con la presencia o la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el fármaco inmunosupresor se selecciona de entre el grupo que consiste en ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, y everolimus y la porción de unión es un anticuerpo específico para el fármaco inmunosupresor, donde el anticuerpo se une a una partícula de detección. 60

13. Un equipo para la detección de fármacos inmunosupresores, conteniendo dicho equipo un primer receptor y un segundo receptor que se unen específicamente a un fármaco inmunosupresor diana en dos sitios separados en el fármaco inmunosupresor, conteniendo además dichos primer y segundo receptores un marcador; y una va-riedad de partículas de detección, estando cada una de dichas partículas unida a un agente que se une a dicho 65 marcador.

14. Un equipo para la detección de un fármaco inmunosupresor en una muestra, conteniendo dicho equipo un pri-mer reactivo que contiene una suspensión de una inmunofilina unida a una primera partícula de detección; un segundo reactivo que contiene una suspensión de un receptor de proteínas que se selecciona de entre el grupo que consiste en una proteína asociada a FKBP-rapamicina, calcineurina y un anticuerpo para la calcineurina, 5 estando dicho segundo receptor de proteínas unido a una partícula de detección, donde las partículas de detec-ción se seleccionan de entre el grupo que consiste en micropartículas y nanocápsulas.

15. Un equipo para la detección de rapamicina activa, conteniendo dicho equipo un primer reactivo que contiene una proteína de unión a FK506 (FKBP) enlazada a una primera partícula de detección; un segundo reactivo que 10 contiene una proteína diana de la rapamicina (TOR) enlazada a una segunda partícula de detección, donde la primera y la segunda partícula de detección se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en micropartículas y nanocápsulas.


 

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