ENDOXILANASA TERMORRESISTENTE OBTENIDA POR MUTAGÉNESIS Y SU APLICACIÓN AL PROCESO DE OBTENCIÓN DE BIOETANOL.
Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanal.
La presente invención describe una secuencia peptídica a la se han sustituido una serie de aminoácidos por mutagénesis dirigida a partir de la secuencia codificante de endoxilanasa de Aspergíllus nidulans para obtener una endoxilanasa que presenta una mayor estabilidad térmica. Además, la presente invención se refiere al uso de esta endoxilanasa para la obtención de xilano a partir de materia vegetal y al posterior uso de este xilano en procesos de obtención de bioetanol.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030913.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: RAMON VIDAL,DANIEL, POLAINA MOLINA,JULIO, GENOVES MARTINEZ,SALVADOR, MANZANARES MIR,PALOMA, VALLES ALVENTOSA,SALVADOR, MARTORELL GUEROLA,PATRICIA, MC CABE,Andrew Peter, SANCHEZ HERVAS,Meritxell.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/56 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
- C12N9/42 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
- C12P7/10 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › de un sustrato constituido por materias celulósicas.
Fragmento de la descripción:
Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanol.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una endoxilanasa modificada obtenida por mutagénesis dirigida a partir de la secuencia que codifica para la endoxilanasa de Aspergillus nidulans y al uso de esta endoxilanasa modificada para obtener xilano que posteriormente se emplea en procedimientos de obtención de bioetanol. Por tanto, la presente invención se engloba en el campo de la biotecnología y más particularmente a la biotecnología industrial.
Estado de la técnica anterior
Actualmente, el bioetanol es el biocombustible con mayor producción mundial, del que se elaboraron más de 40.000 millones de litros durante el año 2004 en todo el mundo. Para su fabricación se pueden utilizar una gran cantidad de materias primas, principalmente caña de azúcar, almidón de maíz, remolacha, cereal o residuos forestales, incluso se está estudiando la posibilidad de cultivar árboles, con alto contenido de celulosa, como pueden ser el chopo o el sauce, con el único fin de producir etanol.
Otra alternativa a las cosechas dedicadas a fines energéticos, es el uso de residuos de procesos agrícolas, forestales o industriales, con alto contenido en biomasa. Estos residuos pueden ir desde la paja de cereal a las "limpias" forestales, pasando por los Residuos Sólidos Urbanos (RSU) o las cáscaras de cereal o de arroz. Los residuos tienen la ventaja de su bajo coste, ya que son la parte no necesaria de otros productos o procesos, salvo cuando son utilizados en la alimentación del ganado. Los RSU tienen un alto contenido en materia orgánica, como papel o madera, que los hace una potencial fuente de materia prima, aunque debido a su diversa procedencia pueden contener otros materiales cuyo preproceso de separación incremente mucho el precio de la obtención del bioalcohol.
El proceso de degradación de los residuos vegetales se lleva a cabo mediante el empleo de reactores enzimáticos industriales que se alimentan con dichos residuos. La degradación se realiza mediante el uso de complejos enzimáticos comerciales que son una mezcla heterogénea de distintas actividades enzimáticas (fundamentalmente celulasas y hemicelulasas) capaces de degradar la malla de la pared celular vegetal. En estos reactores es posible degradar la pared celular vegetal a sus monosacáridos constituyentes. Tras esta degradación, el medio de reacción se transfiere a un termentador y se usa como fuente de carbono para el crecimiento de un microorganismo, en casi todos los casos descritos una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que lo aprovecha para producir bioetanol mediante la fermentación alcohólica. Sin embargo, a pesar de la metodología desarrollada, aun existen algunas barreras tecnológicas para el uso a gran escala de estas tecnologías. Una de las más importantes hace referencia a los altos costes de compra de los complejos enzimáticos cuyos componentes presentan baja actividad específica y poca adecuación tecnológica a las condiciones del proceso. La temperatura a la que se llevan a cabo estos procesos es uno de los factores limitantes de la actividad enzimática, por lo que la búsqueda de enzimas termoestables resulta imprescindible.
Dentro de las hemicelulasas, las xilanasas son las principales enzimas responsables de la degradación del xilano. La capacidad de producir estas enzimas, que poseen un amplio espectro de acción, está ampliamente distribuida en el mundo microbiano. Su aplicación se ha dirigido principalmente hacia la industria del papel y de la pulpa. Por ello, se han desarrollado diferentes patentes que proponen el uso de xilanasas en estos procesos, que se llevan a cabo en condiciones alcalinas y a temperaturas a las cuales dichas enzimas deben ser termoestables (ES2146756(T3), US5916795(A), US6083733(A), IN185709(A1), US5736384(A), WO2006104448(A1), WO0068396(A2), US6682923(B1)). Estas xilanasas también juegan un papel importante para aumentar la digestibilidad de piensos animales (US2006193843(A1), US7060482(B1), WO0029587(A1).
El empleo de las xilanasas en los procesos de degradación del material vegetal, previos a la obtención de bioetanol, esta relativamente menos documentado aunque existen diferentes trabajos científicos que demuestran la posibilidad de obtener xilanasas que se adecuen a las condiciones tecnológicas de los mismos (Menon et al., Bioresource Technology 2010, 101, 5366-5373; Kapoor et al., Biochemical Engineering Journal 2008, 38, 88-97,; Polizeli et al., Applied Microbiology and Biotechnology 2005, 67, 577-591.
Descripción de la invención
La presente invención describe una enzima endoxilanasa, obtenida por mutagénesis dirigida a partir de la endoxilanasa de Aspergillus nidulans, que es más termoestable que la enzima nativa. Esta enzima es útil para degradar materiales lignocelulósicos para obtener azúcares que sirvan como fuente de carbono para levaduras productoras de etanol. La endoxilanasa o endo-1,4-beta-xilanasa es un tipo de enzima que degrada el polisacárido lineal beta-1,4-xilano a oligómeros de xilosa, rompiendo así la hemicelulosa que compone la pared celular de las plantas. Aspergillus nidulans es un hongo filamentoso del filum Ascomycota.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 de Aspergillus nidulans, donde dicha secuencia aminoacídica presenta las sustituciones del aminoácido treonina en la posición 92 y del aminoácido serina en la posición 100 por el aminoácido ácido aspártico y las sustituciones del aminoácido asparagina en la posición 102 y del aminoácido alanina en la posición 195 por el aminoácido arginina, respecto a la secuencia nativa que codifica la endoxilanasa XlnA de Aspergillus nidulans.
Una realización preferida de la presente invención se refiere a la secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde la secuencia nucleotídica específica es SEQ ID NO: 2.
La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 puede estar codificada por cualquier secuencia nucleotídica cuya transcripción origine un ARN mensajero y su posterior traducción a la secuencia de aminoácidos. Debido a que el código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas secuencias de nucleótidos.
En adelante, para hacer referencia a cualquiera de las secuencias nucleotídicas descritas en los párrafos anteriores, se puede usar la expresión "secuencia nucleotídica de la presente invención" o "secuencia nucleotídica de la invención".
Otro aspecto de la presente invención es un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según se ha descrito anteriormente.
El término "vector de expresión" se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención, el vector puede comprender la secuencia nucleotídica de la invención que, fusionada al mismo puede replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector. Preferiblemente el vector de expresión es capaz de expresarse en un microorganismo tipo bacteria.
Otro aspecto de la presente invención es el producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, o del vector de la invención. Preferiblemente, el producto de expresión es la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Esta secuencia da lugar a una endoxilanasa con mayor resistencia térmica respecto a la nativa, una vez realizadas las modificaciones post-traduccción y después de que la enzima adquiera la conformación en la que es activa.
El término "producto de la expresión" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a cualquier producto resultante de la expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención. Así pues, como producto resultante de la expresión de la secuencia se entiende, por ejemplo, el ARN que se obtiene de la transcripción de la secuencia, el ARN procesado,...
Reivindicaciones:
1. Secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 de Aspergillus nidulans, donde dicha secuencia aminoacídica presenta las sustituciones del aminoácido treonina en la posición 92 y del aminoácido serina en la posición 100 por el aminoácido ácido aspártico y las sustituciones del aminoácido asparagina en la posición 102 y del aminoácido alanina en la posición 195 por el aminoácido arginina.
2. Secuencia según la reivindicación 1, donde la secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 2.
3. Vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Producto de expresión de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o del vector de expresión según la reivindicación 3.
5. Producto según la reivindicación 4, donde el producto de expresión es SEQ ID NO: 1.
6. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, el vector de expresión según la reivindicación 3, el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, o cualquiera de sus combinaciones.
7. Uso de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
8. Uso del vector de expresión según la reivindicación 3, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa.
9. Uso de la célula según la reivindicación 6, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa.
10. Método para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa que comprende:
11. Método según la reivindicación 10, que además comprende:
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde la secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 2.
13. Uso del producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde dicho producto de expresión es una enzima con actividad endoxilanasa, para la obtención de oligómeros de xilosa a partir de materia vegetal.
14. Método para la obtención de bioetanol que comprende:
15. Método según la reivindicación 14, que además comprende:
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