Emulsiones de aceite en agua microfluidificadas y composiciones de vacuna.

Una composición de vacuna que comprende un glicósido de saponina,

un esterol y un antígeno, en la que, en laformación de dicha composición de vacuna, dicho esterol es añadido a dicho glicósido de saponina, y en la quedicho glicósido de saponina y dicho esterol se asocian entre sí para formar complejos en forma de micelashelicoidales; y en la que dicho antígeno está en mezcla con, pero no integrado dentro de, dichas micelashelicoidales.

Emulsiones de aceite en agua microfluidificadas y composiciones de vacuna Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo de las vacunas y, particularmente, a formulaciones adyuvantes para potenciar la respuesta inmune en animales de veterinaria. En particular, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende un glicósido de saponina, un esterol y un antígeno, en la que, en la formación de dicha composición de vacuna, dicho esterol se añade a dicho glicósido de saponina y en la que dicho glicósido de saponina y dicho esterol se asocian entre sí para formar complejos en forma de micelas helicoidales; y en la que dicho antígeno está en mezcla con, pero no integrado dentro de, dichas micelas helicoidales.

Antecedentes de la invención Las infecciones bacterianas, virales, parasitarias y de micoplasma están extendidas en los animales de veterinaria tales como vacas, cerdos y animales de compañía. Las enfermedades provocadas por estos agentes infecciosos son con frecuencia resistentes a terapia farmacéutica antimicrobiana, lo que no deja ningún medio de tratamiento eficaz. En consecuencia, se está usando cada vez más un enfoque vacunológico para combatir la enfermedad infecciosa en los animales de veterinaria. Un patógeno infeccioso completo puede hacerse adecuado para su uso en una formulación de vacuna después de inactivación química o manipulación genética apropiada. Como alternativa, una subunidad proteica del patógeno puede expresarse en un sistema de expresión recombinante y purificarse para su uso en una formulación de vacuna.

El adyuvante generalmente se refiere a cualquier material que aumente la respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas tradicionales están compuestas de preparación en bruto de microorganismos patógenos muertos, y las impurezas asociadas con los cultivos de microorganismos patológicos podrían actuar como adyuvante para potenciar la respuesta inmune. Sin embargo, cuando se usan preparaciones homogéneas de microorganismo patológico o subunidades proteicas purificadas para vacunación, la inmunidad inducida por dichos antígenos es escasa y se hace necesaria la adición de ciertos materiales exógenos como adyuvante. Además, las vacunas sintéticas y de subunidades son caras de producir. Por lo tanto, con la ayuda de adyuvante, puede requerirse una dosis menor de antígeno para estimular la respuesta inmune, ahorrando de este modo en el coste de producción de vacunas.

Se sabe que los adyuvantes actúan de varias maneras diferentes para potenciar la respuesta inmune. Muchos adyuvantes modifican la red de citocinas asociada con la respuesta inmune. Estos adyuvantes inmunomoduladores pueden ejercer su efecto incluso cuando no están junto con antígenos. En general, los adyuvantes inmunomoduladores provocan una regulación positiva general de ciertas citocinas y una regulación negativa conjunta de otras que conducen a una respuesta Th1 celular y/o una Th2 humoral.

Algunos adyuvantes tienen la capacidad de conservar la integridad conformacional de un antígeno de modo que los antígenos puedan presentarse eficazmente a células efectoras inmunes apropiadas. Como resultado de esta conservación de conformación de antígeno por la formulación de adyuvante, la vacuna tendría un periodo de caducidad aumentado como el mostrado para complejos inmunoestimulantes (ISCOM) . Ozel M., y col; Quaternar y Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom) , J.of Ultrastuc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989) .

Algunos adyuvantes tienen la propiedad de conservar el antígeno como un depósito en el sitio de inyección. Como resultado de este efecto de depósito el antígeno no se pierde rápidamente por eliminación en el hígado. Las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceite actúan a través de este efecto de depósito durante una duración más corta. Por ejemplo, se puede obtener un depósito a largo plazo usando adyuvante completo de Freund (FCA) que es una emulsión de agua en aceite. El FCA típicamente permanece en el sitio de inyección hasta que la biodegradación permite la retirada del antígeno por células presentadoras de antígeno.

En base a su naturaleza física, los adyuvantes pueden agruparse en dos categorías muy amplias, concretamente adyuvantes en partículas y adyuvantes sin partículas. Los adyuvantes en partículas existen como micropartículas. El inmunógeno puede incorporarse o asociarse con las micropartículas. Las sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, complejos inmunoestimulantes, liposomas y nano y micropartículas son ejemplos de adyuvantes en partículas. Los adyuvantes sin partículas son generalmente inmunomoduladores y generalmente se usan junto con adyuvantes en partículas. El dipéptido de muramilo (un componente activo de adyuvante de un peptidoglicano extraído de micobacterias) , copolímeros en bloque no iónicos, saponinas (una mezcla compleja de triterpenoides extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria) , lípido A (un disacárido de glucosamina con dos grupos fosfato y cinco o seis cadenas de ácidos grasos generalmente C12 a C16 de longitud) , citocinas, polímeros de carbohidratos, polisacáridos derivatizados y toxinas bacterianas, tales como toxina de cólera y toxina lábil de E. coli, (LT) son ejemplos de adyuvantes sin partículas.

Algunos de los adyuvantes mejor conocidos son combinación de inmunomoduladores sin partículas y materiales en partículas que podrían transmitir efecto depósito a la formulación adyuvante. Por ejemplo, el FCA combina las propiedades inmunomoduladoras de componentes de Mycobacterium tuberculosis junto con el efecto de depósito a

corto plazo de las emulsiones de aceite.

Se han usado emulsiones de aceite como adyuvante de vacunas durante mucho tiempo. Le Moignic y Pinoy descubrieron en 1916 que una suspensión de Salmonella typhimurium muerta en aceite mineral aumentaba la respuesta inmune. Posteriormente en 1925, Ramon describió el aceite de almidón como una de las sustancias que aumentaban la respuesta antitóxica al toxoide diftérico. Sin embargo, las emulsiones de aceite no se hicieron populares hasta 1937 cuando Freund ideó su formulación de adyuvante ahora conocido como adyuvante completo de Freund (FCA) . El FCA es una emulsión de agua en aceite compuesta de aceite mineral (parafina) mezclado con micobacterias muertas y Arlacel A. El Arlacel A es principalmente monooleato de manida y se usa como un agente emulsionante. Aunque el FCA es excelente en la inducción de una respuesta de anticuerpos, provoca dolor grave, formación de abscesos, fiebre e inflamación granulomatosa. Para evitar estas reacciones secundarias indeseables, se desarrolló adyuvante incompleto de Freund (IFA) . El IFA es similar al FCA en su composición excepto por la ausencia de componentes micobacterianos. El IFA actúa mediante la formulación de depósitos en el sitio de inyección y liberación lenta del antígeno con estimulación de células productoras de anticuerpos.

Otro enfoque para mejorar el FCA se basó en la noción de que el reemplazo de aceite mineral con un aceite biocompatible ayudaría a eliminar las reacciones asociadas con FCA en el sitio de inyección. También se creyó que la emulsión debería ser de aceite en agua en lugar de agua en aceite, debido a que esta última produce un depósito de larga duración en el sitio de inyección. Hilleman y col. describieron un adyuvante basado en aceite “adyuvante 65”, consistente en aceite de cacahuete 86%, Arlacel A 10% como emulsionante y monoestearato de aluminio 4% como estabilizador. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman y Beale, 1983, en New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. y Torrigiani, G.) , Schwabe, Basilea. En seres humanos, el adyuvante 65 fue seguro y potente pero mostró menos adyuvanticidad que IFA. No obstante, el uso del adyuvante 65 se interrumpió debido a su reactogenicidad para el hombre con ciertos lotes de vacuna y reducción de la adyuvanticidad cuando se usó un emulsionante purificado o sintético en lugar de Arlacel A. Las Patentes de Estados Unidos 5.718.904 y

5.690.942 enseñan que el aceite mineral en la emulsión de aceite en agua puede reemplazarse con aceite metabolizable para el fin de mejorar el perfil de seguridad.

Además de la adyuvanticidad y seguridad, la apariencia física de una emulsión también es una consideración comercial importante. La apariencia física depende de la estabilidad de la emulsión. La flotación, sedimentación y coalescencia son indicadores de la inestabilidad de la emulsión. La flotación se produce cuando las fases oleosa y acuosa de la emulsión tienen diferente gravedad específica. La flotación... [Seguir leyendo]

1. Una composición de vacuna que comprende un glicósido de saponina, un esterol y un antígeno, en la que, en la formación de dicha composición de vacuna, dicho esterol es añadido a dicho glicósido de saponina, y en la que dicho glicósido de saponina y dicho esterol se asocian entre sí para formar complejos en forma de micelas helicoidales; y en la que dicho antígeno está en mezcla con, pero no integrado dentro de, dichas micelas helicoidales.

2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, que comprende además un vehículo veterinariamente aceptable.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 2, en la que dicho vehículo veterinariamente aceptable es una emulsión de aceite en agua.

4. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que dicho glicósido de saponina es un glicósido triterpenoide.

5. La composición de vacuna de la reivindicación 4, en la que dicho glicósido triterpenoide es Quil A.

6. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que dicho esterol es colesterol.

7. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno comprende un antígeno viral, un 15 antígeno bacteriano o una combinación de los mismos.

8. La composición de vacuna de la reivindicación 7, en la que dicho antígeno comprende un antígeno de virus de diarrea viral bovina (BVDV) de tipo 1 o tipo 2.