Un procedimiento para el empobrecimiento de moléculas con alta abundancia a partir de una muestra biológica,

cuyas etapas comprenden

a) el sometimiento de la muestra al empobrecimiento por afinidad mediante el empleo de un soporte de afinidad con elevada afinidad para una molécula con elevada abundancia, y

b) el inmunoempobrecimiento mediante el empleo de un soporte de afinidad copulado con un anticuerpo IgY de gallina dirigido contra el suero completo o el plasma completo o contra cualquier fracción del mismo.

Empobrecimiento de proteínas de plasma.

Esta invención se refiere a métodos de análisis y, en particular, se refiere a métodos para el fraccionamiento preliminar de muestras en las que está presente una baja abundancia de moléculas de interés, por ejemplo de proteínas, de polisacáridos o de ácidos grasos, junto con moléculas más abundantes de bajo interés o sin interés. En particular, la invención se refiere a métodos para el empobrecimiento de proteínas con elevada abundancia a partir de muestras biológicas empleándose un soporte de afinidad copulado con un anticuerpo de gallina IgY. El método es aplicable, de manera particular, a muestras de fluidos biológicos humanos tales como el suero, el plasma, las lágrimas, la saliva, el fluido cerebroespinal, los lavados uterinos, el fluido amniótico, el fluido cérvico-vaginal o la orina. Se considera que el método de la invención es especialmente útil para las aplicaciones proteómicas que intervienen en el descubrimiento de biomarcadores.

Fundamento de la invención

Como consecuencia de haberse terminado con éxito la secuencia completa del genoma humano en el proyecto del genoma humano (Human Genome Project) y de los éxitos correspondientes con otros genomas tales como el de ratón y el de rata, existe una urgente necesidad en el sector de determinar la función de las proteínas que codifican estos genomas, y de determinar cuales de estas proteínas son expresadas durante varios estados fisiológicos y patológicos.

La proteómica es un área de investigación que trata de definir la función y los perfiles de expresión relativa de subconjuntos de proteínas codificadas por un genoma dado en un tiempo dado en una ubicación celular dada. La proteómica separa, identifica y caracteriza las proteínas expresadas, retenidas, secretadas o liberadas por una célula o tejido con el fin de establecer su o sus funciones y su relación potencial con el inicio, el tipo, el estadio y la progresión de las patologías, así como la respuesta a la terapia y/o la recaída.

La proteómica puede ser empleada para comparar muestras tisulares procedentes de poblaciones enfermas y sanas, con objeto de identificar proteínas cuya expresión está cambiada por la patología. Las proteínas que están significativamente alteradas en su expresión, en su localización o en su modificación postraducción (PTM) en pacientes con unja patología, en comparación con aquellas correspondientes a un grupo de individuos sanos, pueden representar dianas proteicas para fármacos o para descubrir marcadores biológicos, por ejemplo, biomarcadores de punto final y/o biomarcadores indirectos. Una aplicación de la proteómica consiste en la busca de marcadores biológicos del inicio, de la progresión y del tratamiento de una patología en elementos de la sangre, tal como el suero o el plasma.

Las proteínas del suero son herramientas de diagnóstico útiles y la alteración de la expresión de algunas proteínas del suero es un signo inicial de una fisiología alterada, que puede ser indicativa de una patología. En los laboratorios de diagnóstico rutinario, la identificación de las proteínas en suero específicas, con baja abundancia, asociadas con una patología, está relacionada con métodos de inmunoensayo (RIA o ELISA) pesados que requieren mucho tiempo y con radiomarcaje o con enlace enzimático costosos que únicamente tienen la habilidad de evaluar al mismo tiempo un solo componente proteico. Como consecuencia de la naturaleza heterogénea de la mayoría de los desórdenes fisiológicos, se considera, en general, que un solo marcador no es capaz de hacer una predicción suficiente de una patología de tal manera, que existe la necesidad de más de uno candidato biomarcador para reforzar los ensayos de diagnóstico o de pronóstico ya disponibles. Se ha sugerido que puede ser identificado un panel de marcadores múltiples de diagnóstico/pronóstico en el suero mediante la utilización de enfoques proteómicos que tengan la capacidad de perfilar múltiples biomarcadores (Daly and Ozols, 2002).

Una primera herramienta, empleada en los métodos proteómicos para la separación de proteínas y para el análisis de proteínas consiste en la electrofóresis de gel bidimensional (2DE). Después de la separación por medio de la 2DE, las proteínas son caracterizadas e identificadas, de manera usual, mediante el empleo de la interferometría de desorción láser asistida por una matriz (MALDI), la identificación de las huellas moleculares de la masa peptídica o de otras formas de la espectrometría de masas avanzada, por ejemplo la espectroscopía de masa con electrospray (MS) o espectrometría de tiempo-de-vuelo (TOF)/TOF MS, o espectrometría reforzada en superficie (SELDI-TOF MS), espectrometría de masa de tiempo-de-vuelo con ionización por desorción láser copulada con la investigación de bases de datos proteicos y genómicos.

Infelizmente, es muy difícil el análisis mediante gel por medio de la 2DE de las proteínas en muestras de fluidos biológicos, tales como suero y plasma. Esto se debe a la cantidad limitada de proteína disponible para ser resuelta por medio de un gel, y a la gran variación en la concentración de las proteínas en muchas muestras. Esta variación de concentración se denomina frecuentemente como "rango dinámico". Estos factores dan como resultado datos obtenidos mediante la 2DE a partir de muestras complejas, tales como el suero y el plasma no fraccionados, que están dominados por la presencia de proteínas, que se encuentran en gran abundancia en la sangre, por ejemplo la albúmina del suero humano, la inmunoglobulina G (IgG), la haptoglobina, el fibrinógeno, la transferrina, la α₁-antitripsina, la α₂-macroglobulina, la IgA y la IgM. Seis de estas proteínas (la albúmina, la IgG, la IgA, la α₁-antitripsina, la transferrina y la haptoglobina) constituyen entre el 85 y el 90% de la masa proteica en el suero sanguíneo. En general, se considera que se encuentran en una abundancia elevada las proteínas con una concentración mayor que 1 mg/ml, y dichas proteínas pueden representar entre el 2 y el 60% de la proteína total presente.

De este modo, la aplicación de las tecnologías proteómicas actuales está limitada debido a la presencia de proteínas en elevada abundancia "domésticas" tales como la albúmina y las inmunoglobulinas, que constituyen aproximadamente entre el 60 y el 97% de la proteína total en suero (Georgiou et al, 2001). Tales proteínas impiden la detección de cientos de proteínas con baja abundancia, algunas de las cuales pueden ser potencialmente relevantes para un estado patológico particular. Por otra parte, el modelo ampliamente extendido de albúmina y de inmunoglobulina en el gel 2-DE puede obscurecer, del mismo modo, a las proteínas con un PI similar y con un peso molecular similar. Teóricamente, cuando se elimina la albúmina y la inmunoglobulina, que constituyen conjuntamente entre el 60 y el 97% de la proteína total en suero, podría analizarse entre 3 y 5 veces más proteína. Si las tecnologías proteómicas deben ser empleadas de manera rutinaria para fines de diagnóstico, se requerirá un procedimiento rápido, económico y simple para eliminar las proteínas en elevada abundancia.

De manera particular, la presencia de estas proteínas abundantes limita severamente la utilidad de los métodos empleados en análisis a gran escala de las proteínas presentes en mezclas complejas de proteínas, tal como una electrofóresis monodimensional (IDE), una 2DE, una cromatografía líquida multidimensional y un espectro de masas (MS). Estos métodos se utilizan frecuentemente en la investigación de proteínas con baja abundancia tales como las citocinas, las proteínas de transducción de señal, mediadores hormonales y biomarcadores de cáncer. El problema de rango dinámico está ilustrado en la figura 1, que muestra los resultados de una 2DE de una muestra de plasma humano, no fraccionada. Esto ilustra el problema que se plantea en el caso de las proteínas muy abundantes, tal como la albúmina, que está comprendida en más de un 80% de la proteína total presente en el plasma; véase el círculo en la figura 1. Puesto que la cantidad total de proteína que puede ser cargada sobre un gel está limitada de manera que debe ser aproximadamente menor que 120 mg, la cantidad máxima de proteínas "no-albúmina" que puede ser cargada está limitada a 36 mg aproximadamente, limitando de este modo la aptitud que tiene esta técnica para visualizar y para identificar proteínas biomarcadores con baja... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el empobrecimiento de moléculas con alta abundancia a partir de una muestra biológica, cuyas etapas comprenden

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo IgY de gallina, empleado en la etapa (b), es un anticuerpo policlonal de primera generación.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo IgY de gallina, empleado en la etapa (b), es un anticuerpo policlonal de segunda generación o de una generación superior, dirigido contra el plasma o contra el suero, que ha sido sometido ya, al menos, a una rutina de empobrecimiento por afinidad y/o a un inmunoempobrecimiento con un soporte de afinidad copulado con la IgY dirigido contra plasma o suero homólogo.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (a) se lleva a cabo antes que la etapa (b).

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la molécula con alta abundancia es una proteína.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula con alta abundancia es albúmina o inmunoglobulina.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica es un fluido biológico.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica es un medio acondicionado procedente de un cultivo celular o tisular, o es un extracto tisular o celular.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica es sangre entera, suero o plasma.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que soporte de afinidad empleado en la etapa (a) es una resina de cromatografía de afinidad a tinte.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el tinte es un compuesto de clorotriazina.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el soporte de afinidad es un soporte de afinidad Cibacron blue F3GA.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte de afinidad, utilizado en la etapa (a), es una perla magnética y la separación magnética se lleva a cabo con ayuda de medios magnéticos.

14. Un procedimiento para la separación o para el análisis de una molécula con baja abundancia en una muestra biológica, que comprende la etapa del empobrecimiento de, al menos, una molécula con alta abundancia a partir de la muestra con ayuda de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, como paso previo a que la muestra sea sometida a una o a varias separaciones o etapas analíticas para la separación o para el análisis de la molécula con baja abundancia.

15. Un procedimiento de identificación de la expresión de una molécula con baja abundancia en un mamífero, que comprende la etapa del empobrecimiento de, al menos, una molécula con alta abundancia a partir de una muestra biológica procedente del mamífero, con ayuda de un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, como paso previo a que la muestra sea sometida a una o varias etapas de análisis para detectar la expresión de la molécula con baja abundancia.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, que detecta un cambio en la expresión de la molécula con baja abundancia.