DOMINIOS PROTEICOS DE AFINIDAD A COLINA PARA MEJORAR LA EXPRESION, INMOVILIZACION Y PURIFICACION DE POLIPETIDOS.

Son objetos de la presente invención una secuencia polipeptídica derivada de la del módulo de unión a colina de la amidasa LytA de Streptococcus pneumoniae,

así como un conjunto de vectores de expresión destinados a la obtención, de fusiones traduccionales a la secuencias codificante de dicho polipéptido en bacterias y en levaduras. Son también objetos de invención diversas mejoras estructurales y del procedimiento de purificación, que permiten mejorar la expresión y estabilidad de las fusiones, además de minimizar interferencias con el polipéptido fusionado y optimizar la separación proteolítica del citado módulo. Como ejemplos de realización se describe la construcción de un conjunto de vectores plasmídicos con las señales operativas necesarias para la expresión en bacterias o en levaduras de una de estas secuencias, y que permiten su fusión a genes heterólogos para obtener proteínas híbridas que pueden inmovilizarse en una variedad de soportes, y eventualmente purificarse mediante cromatografía de afinidad

Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresión, inmovilización y purificación de polipéptidos.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a la utilización de una secuencia polipeptídica que, fusionada a una proteína de interés, permite su inmovilización en determinados soportes mediante afinidad específica por los mismos, y su posterior purificación a partir de éstos en un sólo paso. Se describe también un conjunto de vectores plasmídicos con los elementos genéticos adecuados para facilitar la expresión recombinante de proteínas fusionadas a la mencionada secuencia polipeptídica, tanto en bacterias como en levaduras, así como los procedimientos necesarios para llevar a cabo los procesos de inmovilización y purificación citados. El sector de la técnica al que puede aplicarse esta invención comprende por tanto la producción, inmovilización y purificación de polipéptidos y proteínas de interés biotecnológico, ya sea con fines industriales, agronómicos, terapéuticos o de diagnóstico en biomedicina, o como herramienta de investigación y análisis en el ámbito de las ciencias de la vida.

Estado de la técnica

La inmovilización de enzimas en soportes sólidos, así como la purificación de proteínas en un sólo paso cromatográfico son dos procesos de esencial interés en Biotecnología que muchas veces comparten un procedimiento previo común: la fusión de la proteína de interés con un polipéptido o "tag" de afinidad que posibilita una interacción fuerte con un soporte sólido (Uhlén, M. et al (1992). Curr. Op. Biotechnol. 3, 363-369; Waugh. (2005). Trends Biotechnol. 23, 316-320). La adición a dicho soporte de un extracto celular de un organismo en el que se ha producido la expresión de la proteína híbrida posibilita la unión específica de la fusión al soporte, y la eliminación del resto de proteínas mediante el lavado exhaustivo del mismo. En este punto puede optarse, bien por utilizar la actividad enzimática así retenida, bien por eluir de manera selectiva la proteína híbrida mediante la adición de un ligando competidor (base de la cromatografia de afinidad), con el resultado de un alto grado de pureza en la preparación final de la proteína de interés.

La inmovilización de una enzima en una fase sólida facilita su recuperación y reutilización en un reactor (Trevan, M.D. et al (1990). En: Biotecnología Básica. Ed. Acribia, Zaragoza, España.). Además, las interacciones que el soporte mantiene con la enzima y su capacidad para resguardarla del disolvente pueden incrementar la estabilidad de la misma, y por tanto su rendimiento. Dentro de los métodos de inmovilización que se utilizan, los procedimientos de unión no covalente al soporte presentan varias ventajas frente a los procedimientos de unión covalente. En el primer caso, se pueden utilizar soportes muy variados que no es necesario activar, reduciéndose al mínimo las posibilidades de distorsión estructural de la proteína al no modificarla covalentemente. Además, la unión no covalente es en general un proceso reversible, permitiendo la regeneración de los soportes, de los cuales existe una amplia gama disponible comercialmente como puede comprobar cualquier experto en la materia.

En cuanto a la cromatografía de afinidad, es obvio que la reducción en el número de pasos de purificación de una proteína se traduce no sólo en un mayor rendimiento, sino además en un incremento de la pureza y un estimable ahorro de tiempo y esfuerzo.

Los módulos de unión a colina (ChBM, "choline-binding modules") constituyen una familia de polipéptidos que forman parte de las denominadas proteínas de unión a colina (ChBP, "choline-binding proteins"), presentes en una variedad de microorganismos (Swiatlo, E. et al (2004). En: The Pneumococcus. American Society for Microbiology Press, Washington DC). Los ChBMs constan a su vez de la repetición de secuencias muy conservadas de aproximadamente 20 aminoácidos (ChBR o "choline-binding repeats"; código Pfam PF01473: http://www.sanger.ac.uk//cgi-bin/Pfam/getacc?PF01473.), que forman estructuras del tipo bucle-horquilla-ß (Fernández-Tornero, C. et al (2001). Nat. Struct. Biol. 8, 1020-1024.). Dos ChBRs consecutivas configuran un sitio de unión a colina. La afinidad de los ChBMs por colina y análogos estructurales de la misma (Sanz, J.M. et al. (1988). FEBS Lett. 232, 308-312.), ha permitido poner a punto un sistema eficaz de purificación de proteínas de fusión con algunos de estos ChBMs (Sánchez-Puelles, J.M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 203, 153-159.). Básicamente, el procedimiento consiste en aplicar un extracto celular conteniendo la proteína de fusión sobre un soporte derivatizado con aminas terciarias o cuaternarias. La proteína así inmovilizada mantiene su funcionalidad, y puede ser eluída fácilmente mediante la adición de un ligando competidor, como la colina. El procedimiento así descrito es la base de una patente anterior (ES 2 032 717).

La Tabla 1 muestra un estudio comparativo de las características de los "tags" de afinidad más comúnmente utilizados junto con el sistema de los módulos de unión a colina (Sánchez-Puelles, J.M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 203, 153-159; Lichty, J.J. et al (2005) Protein Expression and Purification 41, 98-105; Waugh, D.S. (2005) Trends Biotechnol. 23, 316-320). Según se desprende del estudio, el procedimiento objeto de esta patente posee una serie de ventajas específicas que lo hace altamente competitivo, y que justifica su explotación para convertirse en un procedimiento extendido de inmovilización y purificación de proteínas. Fundamentalmente, el sistema es altamente específico, puede utilizar una gran variedad de soportes ya disponibles comercialmente (resinas, papel, placas multipocillo, etc...), muestra muy pocas incompatibilidades, y posee todas las atribuciones necesarias para pensar en un escalado eficiente para su empleo en biorreactores a nivel industrial.

Ámbito de la invención

La presente invención es útil para la expresión, inmovilización y purificación de proteínas de interés mediante fusión a las secuencias polipeptídicas descritas. Por tanto, puede servir para elaborar productos de utilidad para industrias de reactivos y herramientas de investigación en ciencias de la vida. Además, se puede aplicar a la industria química para la purificación de enzimas útiles, para la construcción de biorreactores enzimáticos para síntesis o análisis químicos, o procesos que requieran biotransformación, incluso dentro del ámbito agroalimentario. También es igualmente aplicable a la industria farmacéutica y sanitaria en general, para producir y purificar proteínas recombinantes aplicables al diagnóstico y terapias, así como para la elaboración de matrices de proteínas inmovilizadas de aplicación en proteómica.

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Descripción detallada de la invención

El objeto de la presente invención comprende la inmovilización por unión no covalente y la purificación de proteínas recombinantes basándose en su fusión a unas secuencias polipeptídicas derivadas de la del dominio de unión a colina de la amidasa lítica LytA de S. pneumoniae (C-LytA), mediante sistemas genéticos que permiten su expresión en bacterias y en levaduras. La presente invención describe mejoras del método general descrito en una patente anterior (ES 2 032 717), ya que define el uso de una región concreta del dominio C-LytA y abre un abanico de posibilidades de utilización de este sistema en condiciones no estándar de temperatura y pH.

La presente invención comprende el uso de una versión recortada de una secuencia de DNA (SEQ ID Nº 1, codificante de C-LytA, SEQ ID Nº 2), así como de una variante mutante de la misma, que codifican polipéptidos más pequeños y con niveles de expresión superiores a los del polipéptido original C-LytA completo, manteniendo o mejorando sus propiedades para la inmovilización y purificación de polipéptidos recombinantes de fusión en soportes sólidos derivatizados con aminas terciarias y cuaternarias.

El polipéptido recortado derivado de C-LytA, LYTAG2 (SEQ ID Nº 3) posee 131 aminoácidos y un peso molecular de 14.62 kDa. Los aminoácidos 1-104...

1. Secuencia nucleotídica aislada, derivada de la SEQ1 ID Nº 1, que comprende una secuencia codificante de un polipéptido derivado del dominio de afinidad a colina de la proteína LytA de S. pneumoniae, caracterizado porque: