DISPOSITIVOS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA DETECCIÓN DE INTERACCIONES MOLECULARES.

Dispositivo para la detección cualitativa y/o cuantitativa de interacciones moleculares entre moléculas sondas y blanco en una solución de muestra,

que contiene: un microconjunto con un sustrato (1.5), sobre el cual están inmovilizadas moléculas sondas sobre elementos del conjunto, en donde el microconjunto (1.5) está dispuesto sobre una primera superficie del dispositivo; y una cámara de reacción (1.1), que se forma entre la primera superficie con el microconjunto dispuesto sobre ella (1.5) y una segunda superficie, en donde la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie es modificable; caracterizado por que el dispositivo también contiene un medio (2) para modificar la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie de modo tal que se elimine esencialmente la solución de la muestra entre el microconjunto y la segunda superficie, sin eliminar la solución de la muestra de la cámara de reacción (1.1)

Dispositivos y procedimientos para la detección de interacciones moleculares.

La invención se refiere a dispositivos y procedimientos para la detección de interacciones específicas entre moléculas blanco y moléculas sonda.

Los ensayos biomédicos se basan frecuentemente en la detección de una interacción entre una molécula que se encuentra disponible en una cantidad y posición conocidas (la sonda molecular) y una molécula desconocida a ser detectada o bien más de una moléculas desconocidas a ser detectadas (las moléculas blanco o apuntadas). En el caso de los ensayos modernos las sondas están registradas en forma de una biblioteca de sustancias sobre vehículos, los denominados microconjuntos (microarrays) o chips, de manera tal que es posible analizar una muestra paralelamente en varias sondas (ver, por ejemplo, D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836). En este caso, para la preparación de los microconjuntos se inmovilizan usualmente las sondas de una manera y modalidad prefijadas, por ejemplo en una matriz descrita en el documento WO 00/12575 (ver, por ejemplo, los documentos 5.412.087, WO 98/36827) o bien se los genera sintéticamente en (ver, por ejemplo, el documento US 5.143.854).

La condición preliminar para la ligazón de una molécula blanco marcada por ejemplo con un grupo de fluorescencia, en forma de una molécula de ADN o de ARN, a una sonda de ácidos nucleicos del microconjunto es que tanto la molécula blanco como también la molécula sonda se encuentren presentes en forma de ácido nucleico monofilamento. Es solamente entre moléculas de este tipo que puede tener lugar una hibridación eficiente y específica. Las moléculas blanco y sonda de ácidos nucleicos monofilamento se obtienen por lo general por desnaturalización térmica y elección óptima de parámetros tales como temperatura, intensidad iónica y concentración de moléculas desestabilizadoras de hélice. De esta manera se garantiza que solamente permanecen acopladas con la secuencia objeto las sondas con secuencias complementarias de manera aproximadamente perfecta, es decir correspondientes entre sí. (A.A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, HeidelbergBerlin/Oxford).

Un ejemplo típico para la utilización de microconjuntos en procedimientos de ensayos biológicos es la detección de microorganismos en muestras en el diagnóstico biomédico. En este caso se aprovecha el hecho de que los genes para el ARN ribosomal (rRNA) están distribuidos de manera ubicua y disponen de secciones de secuencia que son características para la especie correspondiente. Estas secuencias características para la especie se aplican en forma de oligonucleótidos de ADN monofilamento sobre un microconjunto. La molécula de ADN objeto a ser investigada se aísla en primera instancia a partir de la muestra a ser investigada y se la provee con marcadores, por ejemplo marcadores fluorescentes. Seguidamente se incuba la molécula de ADN marcada en una solución con la sonda aplicada sobre el microconjunto, se retiran las interacciones que se presentan de manera no específica mediante pasos de lavado correspondientes, y se detectan interacciones específicas por evaluación de óptica de fluorescencia. De esta manera y modo es posible detectar con un sólo test en una muestra simultáneamente por ejemplo varios microorganismos. En estos procedimientos de ensayo, la cantidad de microorganismos detectables depende teóricamente sólo de la cantidad de sondas específicas que se aplican sobre el microconjunto.

En la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.º 2004/0018523 se describe un procedimiento para la realización de reacciones biológicas sobre una capa de sustrato que abarca una pluralidad de lugares de ligazón de oligonucleótidos. En este documento se describe además una cámara de hibridación en el cual se llevan a cabo hibridaciones de ácidos nucleicos. En este caso se lleva a reacción un material biológico sobre un biochip con un sustrato que presenta un array de lugares de ligazón de oligonucleótidos.

Para la detección de interacciones moleculares con ayuda de microconjuntos o bien de sondas sobre superficies sólidas se describe una serie de métodos y sistemas técnicos, de los cuales algunos pueden obtenerse en el comercio.

Los sistemas clásicos para la detección de interacciones moleculares se basan en la comparación de las intensidades de la fluorescencia de moléculas blanco marcadas con fluoróforos excitados espectralmente de manera selectiva. La fluorescencia es la propiedad de determinadas moléculas, al ser excitadas con luz, de emitir una luz por sí mismas con una determinada longitud de onda. En el análisis, al aumentar la densidad molecular marcada sobre la superficie generalizada, por ejemplo mediante una eficiencia creciente de la interacción molecular entre moléculas blanco y moléculas sonda, se supone un incremento proporcional de la señal de fluorescencia.

La detección, en especial cuantitativa, de las señales de fluorescencia se lleva a cabo mediante procedimientos modificados de la microscopia de fluorescencia. En este caso se separa la luz de la longitud de la sonda de absorción con respecto a la longitud de la onda de emisión mediante filtros o dicroicos y se representa la señal de medición mediante elementos ópticos tales como objetivos y lentes sobre detectores adecuados, como por ejemplo conjuntos de CCD bidimensionales de manera de obtener imágenes. Por lo general el análisis tiene lugar mediante elaboración digital de imágenes.

Las soluciones técnicas hasta ahora conocidas se diferencian en cuanto a su estructura óptica y en cuanto a los componentes utilizados. Pueden resultar problemas y limitaciones debido a los ruidos de las señales (segundo plano) que son esencialmente determinados por efectos tales como blanqueo y apagado de las sustancias colorantes empleadas, autofluorescencia de los medios, elementos de ensamble y componentes ópticos así como dispersiones, reflexiones y luz extraña en la estructuración óptica.

De ello resulta una elevada complicación técnica para el montaje de detectores de fluorescencia de alta sensibilidad para la comparación cualitativa y cuantitativa de conjuntos de sondas. En especial para la clasificación con rendimientos horarios medianos y elevados se requieren sistemas de detección especialmente adaptados, que posean un determinado grado de automatización.

Para la optimización de estructuras de epifluorescencia estándar para la lectura de conjuntos moleculares se conocen detectores basados en CCD, que para la discriminación de efectos ópticos como la dispersión y las reflexiones llevan a cabo la excitación de los fluoróforos en el campo oscuro por iluminación superior o por iluminación pasante (ver, por ejemplo, C. E. Hooper et al., Quantitative Photon Imaging in the Life Sciences Using Intensified CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), S. 337-344). En este caso, la configuración del conjunto tiene lugar sea en una iluminación o a través de una grilla bajo utilización de una óptica de resolución más elevada. La utilización de fuentes de iluminación multiespectrales posibilita un acceso relativamente sencillo a diversos fluoróforos mediante la utilización de diversos filtros de excitación (o de combinaciones de filtros de excitación). Sin embargo, la desventaja es que la autofluorescencia y los efectos ópticos impuestos por el sistema tales como la homogeneidad de la iluminación sobre el conjunto requieren ópticas de iluminación y sistemas de filtrado complicados.

Otros métodos para la detección cuantitativa de las señales de fluorescencia se basan en la microscopia de fluorescencia confocal. Por ejemplo, en el documento US 5.304.810, los sistemas de escaneo confocales descrito se basan sobre la selección de señales de florescencia a lo largo de los ejes ópticos de dos pinoles. De ello resulta una mayor complicación de ajuste de las muestras o bien para el establecimiento de un sistema de autofocus eficiente. Desde el punto de vista técnico, tales sistemas son de alta complejidad. Los componentes requeridos tales como láser, pinholes, detectores eventualmente refrigerados tales como por ejemplo PMT, diodos de avalancha o CCD, elementos de traslación mecánicos y ópticas de alta complejidad deben optimizarse e integrarse entre si, lo que es muy complejo, (ver, por ejemplo, los documentos US 5.459.325; US 5.192.980; US 5.834.758)....

1. Dispositivo para la detección cualitativa y/o cuantitativa de interacciones moleculares entre moléculas sondas y blanco en una solución de muestra, que contiene: un microconjunto con un sustrato (1.5), sobre el cual están inmovilizadas moléculas sondas sobre elementos del conjunto, en donde el microconjunto (1.5) está dispuesto sobre una primera superficie del dispositivo; y una cámara de reacción (1.1), que se forma entre la primera superficie con el microconjunto dispuesto sobre ella (1.5) y una segunda superficie, en donde la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie es modificable; caracterizado por que el dispositivo también contiene un medio (2) para modificar la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie de modo tal que se elimine esencialmente la solución de la muestra entre el microconjunto y la segunda superficie, sin eliminar la solución de la muestra de la cámara de reacción (1.1).

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie es modificable en un área de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 mm.

3. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el dispositivo comprende además una unidad de control y/o regulación de temperatura para controlar y/o regular la temperatura en la cámara de reacción (1.1).

4. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la unidad de control y/o regulación de temperatura está integrada en la primera superficie.

5. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la unidad de control y/o regulación de temperatura comprende bloques de temperatura que se precalientan a una temperatura definida.

6. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los bloques de temperatura están dispuestos en forma lineal o sobre un plato giratorio.

7. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo comprende un sistema de detección (4).

8. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el sistema de detección (4) es un sistema óptico, con preferencia, un sistema óptico de fluorescencia.

9. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el sistema óptico de fluorescencia es un microscopio de fluorescencia sin autofocus.

10. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el sistema de detección (4) está unido a un separador que regula cuando se coloca sobre la segunda superficie una distancia entre el sistema de detección (4) y la segunda superficie.

11. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde para el ambiente de reacción formado entre la primera y la segunda superficie (1.1) están previstas áreas de compensación adyacentes lateralmente que, al reducir la distancia entre un microconjunto (1.5) y la segunda superficie, mantienen esencialmente constante el volumen en la cámara de reacción (1.1).

12. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda superficie se conforma de un material ópticamente transparente, con preferencia, vidrio.

13. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el área de reacción formada entre la primera y la segunda superficie (1.1) está limitada lateralmente por juntas elásticas (2.2).

14. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera superficie está conformada al menos en el área por debajo del microconjunto (1.5) de modo que un microconjunto (1.5) se puede guiar a la segunda superficie de forma que la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie sea modificable.

15. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la primera superficie es elásticamente deformable al menos en el área por debajo del microconjunto (1.5).

16. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la primera superficie está conformada de un plástico elástico.

17. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la primera superficie está conformada por medio de dos capas superpuestas, en donde una capa externa de ambas capas superpuestas presenta una entalladura al menos en el área por debajo del microconjunto.

18. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 17, en donde una capa interna de ambas capas superpuestas está formada por una junta elástica (2.2).

19. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el dispositivo comprende por lo menos un medio (2) para la modificación de la distancia con la que el microconjunto (1.5) se puede conducir respecto a la segunda superficie.

20. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el microconjunto (1.5) se puede conducir por presión y/o tracción del medio sobre la primera superficie respecto de la segunda superficie.

21. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en donde la primera superficie se puede desplazar por el medio en vibración.

22. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda superficie se puede conducir respecto de la primera superficie de modo que sea modificable la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie.

23. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 22, en donde la segunda superficie se puede conducir por presión y/o tracción del separador sobre la segunda superficie respecto de la primera superficie de modo tal que sea modificable la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie.

24. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera superficie y la segunda superficie se pueden conducir de forma tal que sea modificable la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie.

25. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cámara de reacción (1.1) es una hendidura capilar entre el portacámara y el microconjunto.

26. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la hendidura capilar presenta un espesor en el intervalo de aproximadamente 0 Pm a aproximadamente 100 Pm.

27. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde la cámara de reacción (1.1) comprende por lo menos dos subcámaras, en donde en un primer estado no comprimido las subcámaras están unidas fluídicamente entre sí y en un segundo estado comprimido, no hay una conexión fluídica entre las subcámaras.

28. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 27, en donde cada subcámara está asignada a un área definida del microconjunto (1.5).

29. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28, en donde el microconjunto (1.5) y/o la segunda superficie está provista de cavidades que sirven como paredes entre las subcámaras.

30. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a 29, en donde las paredes entre las subcámaras están formadas por juntas elásticas (2.2).

31. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo comprende además una unidad de llenado (1) y/o unidad de elaboración para la purificación y/o concentración de una solución de muestra y/o control de la carga y/o descarga de la cámara de reacción (1.1) con fluidos.

32. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la cámara de reacción (1.1) y la unidad de llenado (1) o bien la unidad de elaboración están conectadas entre sí a través de dos cánulas, en donde las cánulas están dispuestas de modo tal que una primera cánula garantiza que se lleven fluidos de la unidad de llenado (1) o la unidad de elaboración a la cámara de reacción (1.1) y una segunda cánula que garantiza el escape del aire desplazado a través de los fluidos transportados de la cámara de reacción (1.1).

33. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo comprende una unidad unida con el sistema de detección (4) para el procesamiento de señales registradas por el sistema de detección.

34. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo presenta adicionalmente una interfaz para computadoras externas.

35. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo está provisto de una codificación, preferentemente una matriz de datos o un código de barras, que contiene informaciones sobre la biblioteca de sustancias y/o la realización de la reacción de multiplicación y/o detección.

36. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde las moléculas sonda y/o moléculas blanco son biopolímeros que están seleccionados del grupo compuesto por ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, antígenos, anticuerpos, hidratos de carbono y/o sus análogos y/o polímeros de mezcla de los biopolímeros previamente mencionados.

37. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde las moléculas sonda y/o moléculas blanco son ácidos nucleicos y/o análogos de ácidos nucleicos.

38. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo presenta un cuerpo de cámara de material conductivo eléctrico.

39. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el material conductivo eléctrico es plástico eléctricamente conductivo.

40. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el plástico eléctricamente conductivo está seleccionado del grupo compuesto por poliamida con 5-30% de fibras de carbono, policarbonato con 5-30% de fibras de carbono, poliamida con 2-20% de fibras de acero inoxidable y PPS con 5-40% de fibras de carbono.

41. Procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de interacciones moleculares entre sonda y moléculas blanco, que comprende las siguientes etapas:

(a) incorporación de una solución de muestra que contiene moléculas blanco en una cámara de reacción (1.1), que se forma entre una primera superficie con un microconjunto dispuesto sobre ella (1.5) y una segunda superficie, en donde el microconjunto (1.5) comprende un sustrato con moléculas sondas inmovilizadas sobre elementos del conjunto;

(b) detección de una interacción entre las moléculas blanco y las moléculas sondas inmovilizadas sobre el sustrato, caracterizado por que entre la incorporación de la solución de muestra que contiene moléculas blanco en la cámara de reacción (1.1) y la detección no se produce una eliminación de soluciones de la cámara de reacción (1.1) y en donde en la etapa (b) la distancia entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie está tan modificada que la solución de la muestra entre el microconjunto (1.5) y la segunda superficie se elimina de modo esencial.

42. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, en donde la distancia entre un microconjunto (1.5) y la segunda superficie antes de la detección se mantiene en una posición que permite la interacción entre las moléculas blanco y las moléculas sondas inmovilizadas sobre el sustrato.

43. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41 ó 42, en donde las moléculas blanco se proveen de un marcador detectable.

44. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 43, en donde el marcador detectable es un marcador de fluorescencia.

45. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 44, en donde la detección de los marcadores de fluorescencia se realiza por medio de un microscopio de fluorescencia sin autofocus.

46. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la detección de los marcadores de fluorescencia se realiza por medio de un microscopio de fluorescencia con foco fijo.

47. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 41 a 46, en donde las moléculas sondas y/o moléculas blanco son ácidos nucleicos y/o análogos de ácidos nucleicos.

48. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, en donde las moléculas blanco en la cámara de reacción (2.3) se amplifican por medio de una reacción de amplificación cíclica.

49. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 48, en donde la detección después de uno o varios ciclos se realiza durante la reacción de amplificación cíclica y/o después de la reacción de amplificación cíclica.

50. Uso de un dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 40 para realizar ensayos a base de microconjuntos.