Dispositivo para cultivo celular y tisular.

Un dispositivo para cultivo organotípico, en el que dicho dispositivo comprende:



un conducto de medio que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado por una membrana porosa fusionada a su través; y un marco que sujeta el conducto de medio en una orientación sustancialmente vertical en el que el conducto de medio está adaptado para permitir la retención por capilaridad de un volumen suficiente del medio de cultivo líquido en el conducto de medio para contactar la superficie de la membrana porosa y, de este modo, suministrar nutrientes a las células que se pueden cultiva sobre la membrana porosa, en el que el dispositivo comprende además un conducto de suspensión celular que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado por la superficie de dicha membrana porosa contralateral a la superficie de dicha membrana porosa sellada a dicho conducto de medio;

en el que dicho marco sujeta el conducto de medio y el conducto de suspensión celular en una orientación sustancialmente vertical.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2006/001160.

Solicitante: Capsant Neurotechnologies Ltd.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 24 Cornhill London, EC3V 3ND REINO UNIDO.

Inventor/es: STOPPINI, LUC.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12M3/06 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › C12M 3/00 Equipos para el cultivo de tejidos, de células humanas, animales o vegetales, o de virus. › con medios de filtración, de ultrafiltración, de ósmosis inversa o de diálisis.

PDF original: ES-2377140_T3.pdf

 

Dispositivo para cultivo celular y tisular.

Fragmento de la descripción:

Dispositivo para cultivo celular y tisular.

La invención se refiere al campo del cultivo celular y tisular. En concreto, la invención proporciona un dispositivo nuevo para el cultivo organotípico.

El cultivo tisular es el mantenimiento ex vivo de células que se originaron a partir de un órgano o tejido de un organismo animal o vegetal. Durante muchas décadas se han desarrollado y mejorado tos de cultivo tisular.

El cultivo de las células obtenidas directamente de un órgano o tejido animal o vegetal se denomina cultivo primario. De acuerdo con un procedimiento de cultivo primario, explantes de órganos se introducen en un medio de cultivo estéril adecuado en un vaso de cultivo adecuado con una atmósfera estéril de composición adecuada, de forma que las células crecen a partir de los bordes del explante. Otro abordaje al cultivo primario es disociar las células del órgano o tejido mediante tratamiento enzimático y/o mecánico y cultivar las células disociadas en un ambiente adecuado, como se ha descrito anteriormente;

Una desventaja de los cultivos primarios de células animales es que las células tienen un ciclo de vida limitado. Las células en cultivo primario pueden sufrir división celular, pero normalmente sólo lo hacen un número limitado de veces antes de sufrir una forma de muerte celular denominada senescencia. Otra desventaja del cultivo primario de células animales basado en explantes es que las células cultivadas normalmente pierden muchas de las características que son típicas de las células en el órgano fuente in vivo, a menos que se realicen etapas específicas para prevenir dicha pérdida de características. La pérdida de características in vivo durante el cultivo primario basado en explantes o basado en células disociadas y la aparición de líneas de células inmortales tienen implicaciones importantes para la investigación biológica y médica y el desarrollo del producto porque significa que dichos cultivos celulares primarios no se pueden usar para predecir respuestas in vivo con exactitud. Como resultado, se deben llevar a cabo muchos ensayos biológicos para evaluar la seguridad y la eficacia de los fármacos candidatos, in vivo en animales enteros. Dichos ensayos con animales enteros son caros, conducen a costes sanitarios mayores y pueden comprometer el bienestar del animal. Por tanto, durante muchos años ha habido un considerable ímpetu en lo referente al desarrollo de ensayos in vitro que predigan con más exactitud una respuesta in vivo.

El cultivo de órganos es el mantenimiento de todo o parte de un órgano animal ex vivo, en condiciones que mantengan la vida y la función del órgano durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, hay procedimientos establecidos para cultivar hígado (Wicks W., 1968) , corazón (Wildenthal K., 1971) e intestino (Corradino R., 1973) . El cultivo de órganos posee una ventaja primordial sobre los cultivos celulares primarios basados en explantes y las líneas celulares en cuanto a que se mantienen la mayoría o todas las propiedades fisiológicas. No obstante, el rendimiento del cultivo de órganos está limitado por las manipulaciones necesarias para extraer quirúrgicamente el órgano del huésped y establecer el sistema de cultivo. Adicionalmente, solo se pueden obtener uno, dos o pocos cultivos por animal donante. Estas limitaciones hacen que el cultivo de órganos sea demasiado lento y caro para la detección selectiva de fármacos y para la detección selectiva dirigida a un fármaco, junto con muchas otras aplicaciones en la investigación biológica.

Un gran avance en el campo del cultivo tisular ha sido la introducción de procedimientos de cultivo organotípico para láminas de órganos y de tejidos. Se cultivaron láminas finas (50-500 !m) de un órgano animal en condiciones en las que las láminas conserven la composición celular, la morfología y las propiedades fisiológicas del órgano del que proceden. Las condiciones en las que se cultivan las láminas de órgano son cruciales para conseguir un cultivo organotípico. Las láminas de órgano se cultivan sobre la superficie superior de una membrana porosa y se les suministra nutrientes desde la superficie inferior de dicha membrana porosa, de modo que la lámina de órgano no queda completamente sumergida sino cubierta sólo por una fina película de medio de cultivo (Stoppini L. y col., 1991) .

La transferencia de gas a la lámina, tanto para la captación de oxígeno como para la eliminación de dióxido de carbono, es mucho más eficiente que cuando la lámina está completamente sumergida en medio de cultivo de acuerdo con los procedimientos del cultivo de explantes. Además, el cultivo organotípico de láminas no sufre las desventajas asociadas con los cultivos primarios basados en explantes y basados en células disociadas tratados con anterioridad. Hay muchos ejemplos de cultivo organotípico de láminas de otros tejidos en base a los mismos principios.

El cultivo organotípico de láminas es significativamente más rápido y más flexible que el cultivo de órganos, pero sigue siendo demasiado lento y caro para la detección selectiva a gran escala necesaria para el descubrimiento de fármacos. Los procedimientos usados para diseccionar órganos de animales o para procesar material humano postoperatorio requieren mucho trabajo y en la mayoría de los laboratorios solo es posible realizar decenas de cultivos en paralelo. Para la detección selectiva de fármacos sería mucho más útil proporcionar miles, decenas de miles o cientos de miles de cultivos en paralelo. Por tanto, el procedimiento ideal para el cultivo organotípico sería uno basado en células disociadas o pequeños agregados de células a partir de un órgano concreto, pero que permitiera el cultivo verdaderamente organotípico.

Sorprendentemente, se ha descubierto que es posible producir un cultivo organotípico a partir de células disociadas

o de pequeños agregados de células (microexplantes o explantes) sobre una membrana mediante su compactación. Los nutrientes se suministran por el lado contralateral de la membrana de acuerdo con las instrucciones de Stoppini

L. et al, 1991. El procedimiento de producir un cultivo organotípico usando células disociadas o microexplantes se describe en las solicitudes pendientes de tramitación del solicitante tituladas “Procedimiento”, presentada en el Reino Unido el 15 de junio de 2005 (documento GB0512214.8) e internacionalmente el 15 de junio de 2006 (documento WO 2006/136953) .

Un aspecto de cultivo organotípico de láminas y de cultivo organotípico a partir de células disociadas o de microexplantes es cuando las láminas o células compactadas se colocan sobre una membrana porosa y se suministra un medio nutriente líquido desde el lado contralateral de la membrana porosa, de modo que los cultivos tisulares o celulares se encuentren en la interfaz gas-líquido. Actualmente se dispone de dispositivos que satisfacen estos requisitos. Por ejemplo, las inserciones de Millicell™ CM con membrana Biopore™ fabricadas por Millipore Corporation consisten en una membrana porosa sellada a un soporte de poliestireno. El soporte de poliestireno superado por la membrana se coloca en una placa Petri que contiene medio líquido, de modo que la superficie inferior de la membrana esté en contacto con el medio líquido, y la lámina de órgano se coloca sobre la superficie superior de la membrana porosa (véase la Nota Técnica 062 de Millipore) . No obstante, los dispositivos disponibles para cultivo organotípico en la técnica anterior tienen una serie de desventajas y no proporcionan condiciones óptimas para cultivo organotípico. Por ejemplo, los dispositivos disponibles actualmente no permiten añadir medio al lado de la membrana porosa contralateral a la masa celular tras la adición de la masa celular a la membrana porosa no permiten cambiar el medio. Sería útil poder especificar de forma individual la alimentación del medio de cultivo a cada cultivo y cambiar cada medio de cultivo de forma independiente para evaluar los efectos del cambio de medio sobre los cultivos. Sería necesario llevar a cabo dicho cambio de cultivo son someter el cultivo organotípico sobre la superficie de la membrana porosa a cambios significativos de presión hidrostática, ya que dichos cambios inducen respuestas de extensión y tensión en los cultivos celulares que podrían confundir los resultados de los ensayos biológicos. Adicionalmente, los dispositivos disponibles actualmente no permiten un rendimiento elevado, es decir no se pueden usar para producir, mantener y detectar múltiples cultivos organotípicos en paralelo.

Por... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un dispositivo para cultivo organotípico, en el que dicho dispositivo comprende:

un conducto de medio que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado por una membrana porosa fusionada a su través; y un marco que sujeta el conducto de medio en una orientación sustancialmente vertical en el que el conducto de medio está adaptado para permitir la retención por capilaridad de un volumen suficiente del medio de cultivo líquido en el conducto de medio para contactar la superficie de la membrana porosa y, de este modo, suministrar nutrientes a las células que se pueden cultiva sobre la membrana porosa, en el que el dispositivo comprende además un conducto de suspensión celular que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado por la superficie de dicha membrana porosa contralateral a la superficie de dicha membrana porosa sellada a dicho conducto de medio;

en el que dicho marco sujeta el conducto de medio y el conducto de suspensión celular en una orientación sustancialmente vertical.

2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el conducto de medio se adapta para permitir la retención por capilaridad de un volumen suficiente de medio de cultivo líquido para el contacto entre la superficie de la membrana porosa en el conducto cuando el dispositivo está en posición vertical o invertida.

3. dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el conducto de medio es un cilindro.

4. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el conducto de suspensión celular es un cilindro.

5. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el conducto de medio es un cilindro que tiene un radio de 0, 5 cm o menor.

6. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la membrana porosa se fusiona en un extremo del conducto de medio mediante cola, termosellado o mediante sellado ultrasónico.

7. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el conducto de suspensión celular se sella a la membrana porosa por un borde presionado contra dicha membrana porosa por un campo gravitacional.

8. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el conducto de suspensión celular se sella a la membrana porosa mediante un sello de neopreno.

9. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el conducto de suspensión celular se sella a la membrana porosa mediante un sello de silicona.

10. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el conducto de suspensión celular se puede eliminar del dispositivo antes del cultivo celular.

11. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el conducto de suspensión celular se sella a la membrana porosa mediante cola, termosellado o sellado ultrasónico.

12. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el conducto de suspensión celular está compuesto por silicona.

13. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el área transversal interna del conducto de suspensión celular es menor que el área transversal interna del conducto de medio.

14. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la membrana porosa es ópticamente transparente.

15. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la membrana porosa está compuesta por politetrafluoroetileno (PTFE) .

16. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el marco sujeta el conducto en orientación sustancialmente vertical de modo que ni el extremo del conducto cerrado por la membrana ni el extremo abierto del conducto está en contacto con ninguna superficie.

17. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el marco sujeta el conducto en orientación sustancialmente vertical de modo que ni el extremo del conducto de suspensión celular en contacto con la membrana esté soportado en un campo gravitacional por dicho marco, impidiendo que se dañe a

dicha membrana.

18. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el dispositivo comprende además una cámara que encierra el extremo abierto del conducto de medio.

19. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la cámara comprende una abertura para poder 5 cambiar el medio de cultivo.

20. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende una tapa que cubre la superficie de la membrana porosa contralateral al mediante de cultivo líquido.

21. Un dispositivo para cultivo organotípico de alto rendimiento, que comprende múltiples dispositivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

22. Un dispositivo para cultivo organotípico de alto rendimiento de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende los dispositivos 96, 384, 1536 o más de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

23. Un dispositivo para cultivo organotípico, en el que dicho dispositivo comprende:

un conducto de medio que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado por una membrana porosa fusionada a su través; y un marco que sujeta el conducto de medio en una orientación sustancialmente vertical en el que el conducto de medio está adaptado mediante la presencia de una restricción para permitir la retención por capilaridad de un volumen suficiente del medio de cultivo líquido en el conducto de medio para contactar la superficie de la membrana porosa y, de este modo, suministrar nutrientes a las células que se pueden cultiva sobre la membrana porosa.


 

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