Dispositivo y método de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) en microchip.

Dispositivo para determinar una concentración de una sustancia biológica activa en una muestra a partir deuna señal óptica emitida durante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA),

realizándose dicho ensayoen la muestra usando fluidos relacionados con ELISA tales como un inmunorreactante marcado con enzima y un sustrato de enzima, comprendiendo el dispositivo:

un microchip (10) que se extiende sustancialmente en un plano, teniendo además el microchip al menos una parte permeablea la luz;

un tubo (17) flexible dispuesto en el interior de un microchip (10) a lo largo del plano del microchip, en el que al menosuna parte de dicho tubo (17) flexible sirve como celda de reacción en la que tiene lugar la reacción relacionada con ELI10SA, emitiéndose desde esa celda la señal óptica durante el ensayo,

comprendiendo la celda de reacción una pluralidad de secciones curvas de dicho tubo (17) flexible, que forman por tantouna celda de reacción que tiene un área (22) de detección grande, estando además dicha celda de reacción dispuestade modo que dicha pluralidad de curvas se extiende en el plano del microchip y la señal óptica se transmite sustancialmentede manera perpendicular al plano del microchip,

un soporte sólido dentro del tubo (17) flexible para alojar y unir un inmunosorbente y alojar fluidos relacionados con ELISAtales como un inmunorreactante marcado con enzima y un sustrato de enzima,

un detector (15), cuyo plano de detección es sustancialmente perpendicular al plano del microchip, para detectar unaseñal óptica debida a la actividad en la celda de reacción, y una pantalla de visualización para presentar visualmente laseñal óptica detectada, caracterizado porque cada segunda curva de dicha pluralidad de curvas de dicho tubo (17)flexible está sustancialmente a 180º de la curva a la derecha y las curvas restantes están sustancialmente a 180º de lascurvas a la izquierda y en el que la distancia entre cada curva del tubo (17) flexible aumenta en un sentido hacia unaposición central de la celda de reacción y disminuye en un sentido desde la posición central de la celda de reacción.

Dispositivo y método de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) en microchip

Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un método de ensayo de una concentración de una sustancia en una muestra. Más precisamente, la invención se refiere a un método para determinar la concentración de una sustancia biológica activa en una muestra por medio de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) realizado en un tubo flexible detectando y cuantificando la radiación emitida a partir del mismo, siendo la radiación proporcional a la cantidad de la sustancia biológica activa que va a someterse a ensayo.

La presente invención también se refiere a un dispositivo para determinar la concentración de una sustancia biológica activa de este tipo en una muestra por medio de dicho ELISA.

Estado de la técnica

Se han usado las reacciones que emiten luz en algunos inmunoensayos basándose en sistemas de fase sólida. Estos ensayos se refieren a información tanto cuantitativa como cualitativa sobre determinadas especies inmunogénicas en una muestra fisiológica, tal como sangre u orina, y emplean una o más moléculas de reconocimiento específicas. Al menos una de las especies reactivas se une a la fase sólida, mientras que la otra está en contacto con el medio líquido que contiene la muestra. El complejo inmunológico resultante puede usarse como método para la determinación de la extensión de la reacción. La extensión de reacción es una indicación de la cantidad de analito en muestras desconocidas y puede emplearse de diversos modos.

Por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas utiliza un inmunorreactante marcado con enzima (antígeno o anticuerpo) y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo unido a un soporte sólido) . En esta técnica analítica sensible, se compleja una enzima con un antígeno o un anticuerpo. Se eliminan mediante lavado las sustancias en exceso que participan en la formación del complejo, y entonces se añade un sustrato que genera una actividad que es directamente proporcional a la cantidad de unión y por tanto a la concentración.

Esta técnica puede llevarse a cabo en varias combinaciones, siendo el procedimiento más usado recubrir los pocillos de una placa de microtitulación con el antígeno y hacerlo reaccionar con un anticuerpo conjugado con una enzima adecuada, por ejemplo peroxidasa del rábano picante o fosfatasa alcalina. Alternativamente, se recubren los pocillos con un anticuerpo monoclonal seguido por una reacción con el antígeno. El antígeno se hace reaccionar posteriormente con otro anticuerpo monoclonal que está conjugado con una enzima adecuada. El primer caso se denomina técnica de ELI-SA mientras que este último se denomina ELISA de tipo sándwich. Aún en otro formato, se recubren los pocillos con el antígeno seguido por una reacción con un anticuerpo monoclonal que se permite además que reaccione con otro conjugado anticuerpo-enzima específico para el primer anticuerpo. En tales ensayos, la enzima actúa como etiqueta para la medición de la extensión de la reacción. Por ejemplo, el número de moléculas de enzima unidas a los pocillos es una indicación de la cantidad de antígeno presente en los pocillos.

En el documento JP-A-62179054, se muestra un inmunoensayo de fase sólida, en el que se determinan pequeñas cantidades de disolución de antígeno mediante la adsorción del antígeno sobre la pared interna de un tubo de polímero y llevando a cabo una reacción antígeno-anticuerpo en la disolución de muestra.

El documento US-A-5 624 850 representa inmunoensayos en tubos capilares translúcidos, especialmente para detectar antibióticos en leche. Se usa un conjugado de proteína que es un hapteno unido covalentemente a una proteína. Se logra la detección irradiando un miembro de par de unión específico conjugado a un marcador fluorescente.

De manera similar, se ha determinado un herbicida en un inmunoensayo competitivo (Dzgoev et al., Analytica Chimica Acta 347 (2097) 87-93) . Tubos capilares de vidrio recubiertos con oro sirvieron como soporte en un ELISA de obtención de imágenes, determinándose el conjugado unido de herbicida/albúmina sérica bovina mediante la cuantificación de la emisión de quimioluminiscencia procedente de la descomposición enzimática de un sustrato luminógeno. La luz emitida a lo largo de toda la longitud de los tubos capilares complicó la interpretación de los datos obtenidos.

Aunque el ELISA es un método inmunoquímico analítico con alta sensibilidad para medir la concentración de todas las proteínas anteriores, existe todavía la demanda de un método más sensible. Se han medido previamente sustancias importantes fisiológicamente, tales como proteínas de fase aguda, dentro de un intervalo de tan sólo aproximadamente 10-7 M, y se han detectado pesticidas en concentraciones de tan sólo 10-10 M.

Sin embargo, también existen métodos altamente sensibles para determinar la concentración de sustancias, tales como proteínas de fase aguda, usando un sistema de ELISA descrito en la técnica anterior. El documento WO 9920998 da a conocer un método sensible de este tipo, en el que se realiza ELISA dentro de un tubo capilar desde el que se emite luz. Se detecta y se cuantifica la luz, y la detección tiene lugar desde sustancialmente la dirección longitudinal del tubo capilar.

El documento WO 0161041 se refiere a un microchip en el que se realiza un ensayo ELISA en un canal principal de una disposición de canales laterales. También se describen otros ensayos en un canal en serpentina o espiral.

Un problema de los métodos y dispositivos de la técnica anterior es que llevan mucho tiempo y son caros. Por tanto, se requiere un ensayo más económico y más rápido, en el que se simplifique el procedimiento de lavado, por ejemplo, de muestras fisiológicas. También se desea lograr un sistema de ensayo que sea robusto y que también pueda usarse en el campo.

Un inconveniente de los métodos y dispositivos según la técnica anterior es que requieren grandes volúmenes de fluido. Posteriormente, esto da como resultado una escasa difusión de los fluidos en los tubos capilares.

Otro problema de los métodos y dispositivos de la técnica anterior es la reproducibilidad insuficiente, que afecta a la precisión del ensayo. Por ejemplo, los resultados de ensayo de métodos que usan un tubo capilar, desde el que se emite luz y la detección de la misma tiene lugar desde la dirección longitudinal del tubo capilar, dependen de la distancia entre la superficie de fluido dentro del tubo capilar y el detector. Así, cada tubo capilar debe llenarse hasta exactamente el mismo nivel para obtener reproducibilidad.

Todavía otro problema de los métodos y dispositivos de la técnica anterior es que el flujo de fluido es difícil de manejar.

Un inconveniente adicional de los métodos y dispositivos según la técnica anterior es que sólo pueden someterse a ensayo procedimientos estáticos.

Sumario de la invención Un objeto de la presente invención es eliminar los inconvenientes y problemas mencionados anteriormente de los métodos y dispositivos de la técnica anterior para someter a ensayo una concentración de una sustancia biológica activa en una muestra por medio de un ELISA. La presente invención proporciona un método y dispositivo eficaces para realizar tales ensayos en el plazo de un corto periodo de tiempo.

El método y el dispositivo según la invención se han desarrollado para el ensayo de una concentración desconocida de una sustancia en una muestra, sometiéndose a ensayo la sustancia en un sistema de ensayo dentro de un tubo flexible detectando y cuantificando la radiación, tal como luz, emitida desde el sistema de ensayo. También pueden usarse otros tipos de radiación, tales como radiación radiactiva o similar, lo que resulta evidente para un experto en la técnica. Sin embargo, se usa preferiblemente luz.

La sustancia que va a someterse a ensayo puede ser una sustancia proteica natural, o una molécula que se une espontáneamente a dicha sustancia. Por ejemplo, la sustancia es una sustancia biológica activa, tal como proteínas, proteínas de fase aguda, virus, bacterias, etc. Un ejemplo de proteínas de fase aguda son marcadores de infarto de miocardio, tales como FABP (proteínas de unión a ácidos grasos) , CK-MB, triponina-T o triponina-I, mioglobina y GPBB (isoenzima BB de la glucógeno fosforilasa) . Un ejemplo de proteínas es cistatina C, que puede usarse como marcador para daños renales. Naturalmente, pueden someterse a ensayo otras sustancias, lo que resulta evidente para un experto en la técnica.

La presente invención comprende un soporte sólido... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para determinar una concentración de una sustancia biológica activa en una muestra a partir de una señal óptica emitida durante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) , realizándose dicho ensayo en la muestra usando fluidos relacionados con ELISA tales como un inmunorreactante marcado con enzima y un sustrato de enzima, comprendiendo el dispositivo:

un microchip (10) que se extiende sustancialmente en un plano, teniendo además el microchip al menos una parte permeable a la luz;

un tubo (17) flexible dispuesto en el interior de un microchip (10) a lo largo del plano del microchip, en el que al menos una parte de dicho tubo (17) flexible sirve como celda de reacción en la que tiene lugar la reacción relacionada con ELI-SA, emitiéndose desde esa celda la señal óptica durante el ensayo,

comprendiendo la celda de reacción una pluralidad de secciones curvas de dicho tubo (17) flexible, que forman por tanto una celda de reacción que tiene un área (22) de detección grande, estando además dicha celda de reacción dispuesta de modo que dicha pluralidad de curvas se extiende en el plano del microchip y la señal óptica se transmite sustancialmente de manera perpendicular al plano del microchip,

un soporte sólido dentro del tubo (17) flexible para alojar y unir un inmunosorbente y alojar fluidos relacionados con ELI-SA tales como un inmunorreactante marcado con enzima y un sustrato de enzima,

un detector (15) , cuyo plano de detección es sustancialmente perpendicular al plano del microchip, para detectar una señal óptica debida a la actividad en la celda de reacción, y una pantalla de visualización para presentar visualmente la señal óptica detectada, caracterizado porque cada segunda curva de dicha pluralidad de curvas de dicho tubo (17) flexible está sustancialmente a 180º de la curva a la derecha y las curvas restantes están sustancialmente a 180º de las curvas a la izquierda y en el que la distancia entre cada curva del tubo (17) flexible aumenta en un sentido hacia una posición central de la celda de reacción y disminuye en un sentido desde la posición central de la celda de reacción.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el microchip (10) comprende una primera entrada (18) para introducir un primer fluido en el tubo (17) flexible y una segunda entrada (19) para introducir un segundo fluido en el tubo (17) flexible.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, en el que el microchip (10) comprende múltiples entradas (21) para introducir múltiples fluidos en el tubo (17) flexible.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el microchip (10) comprende un material transparente o permeable a la luz entre la celda de reacción y el detector (15) .

5. Dispositivo según la reivindicación 4, en el que el microchip (10) está dotado de una capa (25) de reflexión de luz en un sentido opuesto al detector (15) .

6. Dispositivo según la reivindicación 4, en el que el microchip (10) comprende un material impermeable a la luz en un sentido opuesto al detector (15) para reducir la dispersión de luz.

7. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el microchip (10) está formado de un material de plástico o un material de polímero tal como poliestireno.

8. Dispositivo según la reivindicación 7, en el que el microchip (10) es un artículo moldeado por inyección o un artículo moldeado por compresión.

9. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el detector (15) es un fotodiodo, una fotocelda, una fibra óptica, un sensor de estado sólido o un tubo fotomultiplicador para la detección de la luz emitida desde la celda de reacción.

10. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que una sección transversal del tubo (17) flexible está diseñado para reflejar la luz emitida hacia el detector (15) .

11. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el tubo (17) flexible está diseñado con una sección transversal rectangular, triangular, circular o semicircular.

12. Dispositivo según la reivindicación 11, en el que la sección transversal del tubo (17) flexible está diseñada con un lado plano que se extiende hacia el detector (15) y un ápice o un arco que se extiende perpendicular al plano del microchip (10) en un sentido opuesto.

13. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el microchip (10) comprende una pluralidad de celdas de reacción dispuestas por separado para someter a ensayo una pluralidad de sustancias simultáneamente.

14. Dispositivo según la reivindicación 13, en el que el detector (15) está dispuesto para detectar la luz emitida desde cada celda de reacción por separado.

15. Dispositivo según la reivindicación 13, en el que el detector (15) está dispuesto para cubrir una pluralidad de celdas de reacción simultáneamente para detectar la luz emitida desde una pluralidad de celdas de reacción en combinación.

16. Dispositivo según la reivindicación 13, en el que el dispositivo está dispuesto para el análisis múltiple de diversas sustancias biológicas.

17. Dispositivo según la reivindicación 16, en el que el dispositivo está dispuesto para el análisis múltiple de proteínas de fase aguda.

18. Dispositivo según la reivindicación 17, en el que el dispositivo está dispuesto para el análisis múltiple de marcadores de infarto.

19. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el microchip (10) comprende una pluralidad de depósitos (2224) para contener fluidos, dispuestos dentro del microchip (10) .

20. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que un primer depósito (22) y un segundo depósito (23) están dispuestos para contener fluidos para realizar el ensayo, estando los depósitos (22, 23) conectados a la celda de reacción para conducir los fluidos hasta la celda de reacción en un orden predeterminado cuando se inicia el ensayo, y en el que un depósito (24) de desechos está dispuesto para fluidos de desecho.

21. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el tubo (17) flexible se trata en superficie con una superficie modificada a base de poliestireno con una alta afinidad por grupos polares o un recubrimiento químico.

22. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el tubo (17) flexible incluye material de soporte activado para el acoplamiento covalente de una molécula bioactiva a través de un grupo de extremo terminal de la misma, siendo partes funcionales en el material de soporte (material silíceo, por ejemplo partículas de vidrio, sílice coloidal, CPG, hidrogel, etc.) cuando no están activadas para grupos hidroxilo o sulfhidrilo, y en el que se sustituyen átomos de cloro por los grupos hidroxilo o sulfhidrilo para el acoplamiento covalente de la molécula bioactiva a través de grupo amino terminal de la misma