DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS.

La presente invención proporciona procedimientos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes y los productos relacionados con o que se obtienen mediante tales procedimientos. En concreto, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la formación de células que expresan hormonas pancreáticas y células que secretan hormonas pancreáticas. Además, la presente invención también proporciona procedimientos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes sin el uso de una capa de células alimentadoras y los productos relacionados con o que se obtienen mediante tales procedimientos. La presente invención también proporciona procedimientos para promover la secreción de insulina estimulada por glucosa en células productoras de insulina derivadas de células madre pluripotentes. Antecedentes Los avances alcanzados en la terapia de sustitución de células para la diabetes mellitus de tipo I y la escasez de los islotes de Langerhans transplantables han centrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina o células ß apropiadas para injertos. Un enfoque es la generación de células ß funcionales procedentes de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo células madre embrionarias. En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprende tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un procedimiento conocido como gastrulación. Del endodermo, se desarrollarán tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, mediante una etapa intermedia. La etapa intermedia de este procedimiento es la formación del endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan una serie de marcadores, tales como HNF3beta, GATA4, Mixl1, CXCR4 y Sox17. Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios 3 y 4 específicos de etapas (SSEA) y marcadores detectables usando los anticuerpos denominados Tra160 y Tra181 (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de la expresión de SSEA4, Tra160 y Tra181 (si están presentes) y un aumento de la expresión de SSEA1. Las células madre pluripotentes no diferenciadas tienen, comúnmente, actividad fosfatasa alcalina que se puede detectar fijando las células con paraformaldehído al 4% y luego revelando con rojo Vector como sustrato, según lo descrito por el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calf.). Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan comúnmente Oct4 y TERT, según lo detectado mediante RTPCR. Las células madre pluripotentes se cultivan comúnmente sobre una capa de células alimentadoras que sostienen a las células madre pluripotentes de diversos modos. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero que, sin embargo, soporta la proliferación de células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en el cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio acondicionado mediante el cultivo previo con otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo libre de alimentadoras sin diferenciación se mantiene usando un medio definido químicamente. Por ejemplo, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 404 (2000)) y Thompson et al (Science, 6 de noviembre de 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 1147) revelan el cultivo de líneas de células madre pluripotentes procedentes de blastocistos humanos usando una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. Richards et al, (Stem Cells 21: 546556, 2003) evaluaron la capacidad de un grupo de 11 capas diferentes de células alimentadoras de adulto, feto y neonato humanos para mantener un cultivo de células madre pluripotentes humanas. Richards et al. exponen: las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre alimentadoras de fibroblastos cutáneos de adulto conservan la morfología de las células madre embrionarias humanas y permanecen pluripotentes. El documento US20020072117 revela líneas celulares que producen medios que mantienen el crecimiento de células madre pluripotentes de primate en cultivo libre de alimentadoras. Las líneas celulares empleadas son líneas celulares mesenquimales o de tipo fibroblástico obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. El documento US20020072117 también revela el uso de las líneas celulares como una capa de células alimentadoras primarias. En otro ejemplo, Wang et al (Stem Cells 23: 12211227, 2005) revelan procedimientos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas sobre capas de células alimentadoras derivadas de células madre 2 E08855258 28-10-2011   embrionarias humanas. En otro ejemplo, Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306314, 2005) revelan un sistema de células alimentadoras derivado de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas. En otro ejemplo más, Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433440, 2004) revelan una fuente de células alimentadoras obtenida de placenta humana. Amit et al (Biol. Reprod 68: 21502156, 2003) revelan una capa de células alimentadoras derivada de prepucio humano. En otro ejemplo, Inzunza et al (Stem Cells 23: 544549, 2005) revelan una capa de células alimentadoras de fibroblastos de prepucio postnatal humano. El documento US6642048 revela medios que mantienen el crecimiento de células madre pluripotentes (pPS) de primate en cultivo libre de alimentadoras y líneas celulares útiles para la producción de tales medios. El documento US6642048 expone: La presente invención incluye líneas celulares mesenquimales o de tipo fibroblástico obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. Los procedimientos para obtener tales líneas celulares, los medios de procesamiento y las células madre en crecimiento que usan los medios acondicionados se describen e ilustran en la presente revelación. En otro ejemplo, el documento WO2005014799 revela medio acondicionado para el mantenimiento, la proliferación y la diferenciación de células de mamífero. El documento WO2005014799 expone: El medio de cultivo producido según la presente invención está acondicionado por la actividad de secreción celular de células murinas, en particular, por aquellos hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados denominados NMH (Hepatocito murino Met). En otro ejemplo, Xu et al. (Stem Cells 22: 972980, 2004) revelan un medio acondicionado obtenido de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificados genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa telomerasa humana. En otro ejemplo, el documento US20070010011 revela un medio de cultivo definido químicamente para el mantenimiento de células madre pluripotentes. Un sistema de cultivo alternativo emplea medio libre de suero complementado con factores de crecimiento capaces de fomentar la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, 19 de octubre de 2005) revelan un sistema de cultivo libre de suero y libre de alimentadoras en el que las células madre embrionarias se mantienen en medio de sustitución con suero (SR) no acondicionado complementado con factores de crecimiento diferentes capaces de desencadenar una autorrenovación de las células madre embrionarias. En otro ejemplo Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568574, 2006) revelan procedimientos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, usando medios complementados con bFGF. En otro ejemplo, el documento US20050148070 revela un procedimiento para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras fibroblásticas, procedimiento que comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, al menos una transferrina o sustituto de transferrina, al menos una insulina o sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento fibroblástico capaz de activar un receptor de la señalización del factor de crecimiento fibroblástico, en el que el factor de crecimiento se suministra como una fuente distinta de sólo una capa alimentadora fibroblástica y en el que el medio mantuvo la proliferación de las células madre en un estado no diferenciado sin células alimentadoras ni medio acondicionado. En otro ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir células capaces de secretar insulina mediante estimulación con glucosa a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de: a. cultivar las células madre pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, c. diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de las células con una netrina, y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se consigue mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con al menos un factor adicional seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF2, FGF4, FGF7, FGF10, un inhibidor de Sonic Hedgehog y un factor capaz de inhibir a BMP. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con una netrina y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en ácido retinoico, FGF2, FGF4, FGF7, FGF10, un inhibidor de Sonic Hedgehog y un factor capaz de inhibir a BMP durante de aproximadamente uno a aproximadamente seis días o durante aproximadamente seis días. 4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual las células se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente tres días. 6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, ácido retinoico y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente cuatro días. 7. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual las células se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con (a) un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente tres días o (b) un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente cuatro días. 9. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente tres días, tras lo cual se tratan las células con un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, una netrina, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días. 31 E08855258 28-10-2011   10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con (a) un inhibidor de Sonic Hedgehog y, al menos, un factor seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente tres días o (b) un inhibidor de Sonic Hedgehog, un factor capaz de inhibir a BMP, una netrina, ácido retinoico y, al menos, uno de los factores seleccionado del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10 durante aproximadamente cuatro días. 11. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el factor se selecciona del grupo que consiste en FGF2, FGF4, FGF7 y FGF10. 12. El procedimiento de la reivindicación 10(b), en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con HGF7 a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 µg/ml o a una concentración de 20 ng/ml. 13. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico a una concentración de aproximadamente 1nM a aproximadamente 1mM o a una concentración de 1µM. 14. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el inhibidor de Sonic Hedgehog es ciclopamina. 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la ciclopamina se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 10µM o a una concentración de 0,25µM. 16. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el factor capaz de inhibir a BMP es un inhibidor de BMP4. 17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el inhibidor de BMP4 es nogina. 18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con nogina a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a 100 µg/ml o a una concentración de 100 ng/ml. 19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con la netrina a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 100 µg/ml o a una concentración de 100 ng/ml. 20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la netrina se selecciona del grupo que consiste en netrina 1, netrina 2 y netrina 4. 21. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se realiza mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta del TGFßR1. 22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con un factor que inhibe la ruta de TGFßR1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días, durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días o durante aproximadamente doce días. 23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan además con al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en un factor capaz de inhibir a BMP y una netrina. 24. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se realiza mediante el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta de TGFßR1. 25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con un factor que inhibe la ruta de señalización Notch y un factor que inhibe la ruta de TGFßR1 durante de aproximadamente uno a aproximadamente doce días, durante de aproximadamente cinco a aproximadamente doce días o durante aproximadamente doce días. 26. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de la secretasa. 27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el inhibidor de la secretasa es L685.458. 32 E08855258 28-10-2011   28. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que L685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 100µM. 29. El procedimiento de la reivindicación 19 o la reivindicación 22, en el que el factor que inhibe la ruta de TGF ßR1 o la ruta de señalización de TGFßR1 es un inhibidor de la quinasa de TGFßR1. 30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el inhibidor de la quinasa de TGFßR1 se usa a una concentración de aproximadamente 0,1µM a aproximadamente 100µM. 31. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el inhibidor de la quinasa de TGFßR1 es 2(3(6 metilpiridin2il)1Hpirazol 4il)1,5naftiridina o [3(piridin2il)4(4quinonil)]1Hpirazol. 33 E08855258 28-10-2011   34 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   36 E08855258 28-10-2011   37 E08855258 28-10-2011   38 E08855258 28-10-2011   39 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   41 E08855258 28-10-2011   42 E08855258 28-10-2011   43 E08855258 28-10-2011   44 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   46 E08855258 28-10-2011   47 E08855258 28-10-2011   48 E08855258 28-10-2011   49 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   51 E08855258 28-10-2011   52 E08855258 28-10-2011   53 E08855258 28-10-2011   54 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   56 E08855258 28-10-2011   57 E08855258 28-10-2011   58 E08855258 28-10-2011   59 E08855258 28-10-2011   E08855258 28-10-2011   61 E08855258 28-10-2011   62   63   64     66   67   68