Diagnóstico y tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad.

Un método para identificar o ayudar a identificar un individuo que sufre o tiene riesgo de desarrollar degeneraciónmacular relacionada con la edad,

para diagnosticar o ayudar a diagnosticar degeneración macular relacionada con laedad en un individuo, o para evaluar el riesgo de progresión de degeneración macular relacionada con la edad en un individuo, que comprende:

(I) ensayar una muestra obtenida del individuo en busca de la presencia de una base nucleotídica distinta deuna G en la posición 29 en SEC ID No: 69 del gen de HTRA1 humano, en el que la presencia de una basenucleotídica distinta de una G en dicha posición del gen de HTRA1 variante indica que el individuo sufre otiene riesgo de desarrollar o de progresión de degeneración macular relacionada con la edad; o(II)

(a) combinar una muestra del individuo con una sonda polinucleotídica que se hibrida, en condicionesrestrictivas, a una variación en la región reguladora no codificante en dirección arriba de la posición +1del sitio de iniciación de la transcripción putativo del gen de HTRA1 humano que está correlacionadocon la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos, pero no sehibrida a un gen de HTRA1 de tipo salvaje, produciendo de ese modo una combinación;

(b) mantener las condiciones de combinación apropiadas para que se produzca la hibridación; y

(c) determinar si se produce la hibridación, en el que la aparición de hibridación indica que el individuotiene riesgo de desarrollar o progresión de degeneración macular relacionada con la edad; o

(III)(a) secuenciar una región del ADN procedente de un individuo que comprende el nucleótido en laposición 29 en SEC ID No: 69 del sitio de iniciación de la transcripción putativo del promotor del gende HTRA1 en seres humanos; y

(b) determinar si está presente en el ADN una variación de la secuencia de tipo salvaje de la regióndel promotor del gen de HTRA1, en el que la presencia de la variación indica que el individuo tieneriesgo de desarrollar o progresión de degeneración macular relacionada con la edad;

siendo dicha variación una base nucleotídica distinta de una G en la posición 29 en SEC ID No: 69.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/016809.

Solicitante: YALE UNIVERSITY, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2 WHITNEY AVENUE NEW HAVEN CT 06511 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HOH,Josephine, DEWAN,ANDREW.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

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Diagnóstico y tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad.

Fragmento de la descripción:

Diagnóstico y tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad

Financiación del gobierno

Esta invención se obtuvo con apoyo del Gobierno desde el National Institutes of Health con la Concesión nº R01EY15771.

Antecedentes de la invención

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la causa principal de pérdida de visión y ceguera entre individuos ancianos en los Estados Unidos de América y a lo largo del mundo desarrollado. Tiene una etiología compleja que implica factores genéticos y medioambientales. AMD está ampliamente clasificada como seca (no neovascular) o húmeda (neovascular) . La forma seca es más habitual, dando cuenta de aproximadamente 85%-90% de pacientes con AMD, y no da como resultado típicamente ceguera. El signo clínico principal de AMD seca es la presencia de drusen blando con márgenes borrosos (depósitos de proteína extracelulares) entre el epitelio del pigmento retiniano (RPE) y la membrana de Bruch. La acumulación de estos drusen está asociada con atrofia geográfica central (CGA) , y da como resultado visión central borrosa. Alrededor de 10% de pacientes con AMD tienen la forma húmeda, en la que se forman nuevos vasos sanguíneos y se rompen más allá de la retina (neovascularización coroidal [CNV]) . Esta fuga causa daño permanente al tejido retiniano circundante, distorsionando y destruyendo la visión central. El por qué algunos individuos desarrollan la forma húmeda más agresiva de AMD mientras otros tienen el tipo seco que progresa lentamente, no está bien comprendido.

Jakobsdottir et al., 2005 (American Journal of Human Genetics 77 (3) :389-407) describe un método para identificar un individuo con riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , que comprende ensayar el SNP definido por rs10490924 en el gen teórico LOC387715, adyacente a la región reguladora de HTRA1 (véase Materiales y la Tabla 6) . El genotipado se realiza usando sondas específicas de alelos en matrices de SNP de alta densidad (página 392, col. 2) . Este documento también estudia varios SNP en el gen de PRSS11, un nombre alternativo para HTRA1, en busca de la asociación con AMS (véase la Figura 1 y la Tabla 6) .

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de una variación en un gen humano correlacionado con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad, que es útil para identificar o ayudar a identificar individuos con riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad, así como para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de degeneración macular relacionada con la edad (identificar o ayudar a identificar individuos que sufren degeneración macular relacionada con la edad) . Los métodos y composiciones también son útiles para monitorizar el estatus (por ejemplo, progresión o inversión) de la degeneración macular relacionada con la edad. Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para identificar o ayudar a identificar individuos de una variedad de razas y etnias, y, en realizaciones particulares, se llevan a cabo a fin de identificar o ayudar a identificar individuos caucásicos o asiáticos que sufren o tienen riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad. La invención también ser refiere a métodos para identificar o ayudar a identificar individuos que sufren o tienen riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad, y a métodos para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de degeneración macular relacionada con la edad (identificar individuos que sufren / individuos que tienen degeneraciones maculares relacionadas con la edad) .

La presente invención proporciona métodos, kits de diagnóstico y composiciones como se definen en las reivindicaciones.

Los métodos de esta invención pueden comprender, además de determinar si está presente una variante de HTRA1, determinar si una o más variantes adicionales que están correlacionadas con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad están presentes en un individuo que se evalúa. Variantes adicionales, distintas de una variante de HTRA1, que se pueden detectar incluyen, pero no se limitan a, una variación en ácidos nucleicos (ADN, ARN) que codifican la proteína de CFH (por ejemplo, una variación que codifica histidina en la posición 402 de la proteína de CFH) ; una variación que codifica un resto de aminoácido distinto de alanina en la posición 69 de la proteína LOC387715 (por ejemplo, una serina en esa posición) ; y una variación que corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido identificado como rs10490924. Algunas o todas estas variantes, así como otras correlacionadas con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad, se pueden determinar y/o cuantificar en una muestra procedente de un individuo que está siendo evaluado.

La invención se refiere a un método para monitorizar el estado de la degeneración macular relacionada con la edad en un individuo (ser humano) . El método es útil para evaluar, por ejemplo, si la degeneración macular relacionada con la edad ha progresado (ha alcanzado una etapa más avanzada o tardía) en el individuo. Esto es útil, por ejemplo, al evaluar los efectos/eficacia de los tratamientos que ha recibido un individuo. Los métodos de esta invención pueden ayudar a mostrar, por ejemplo, que un tratamiento ha sido eficaz, puesto que pueden mostrar si se ha producido la regresión (mejoría, parcial o completa) de AMD. El método también se puede usar para evaluar si ha progresado (empeorado) AMD en un individuo. Esta realización se puede llevar a cabo, por ejemplo, evaluando el

grado en el que está presente un gen de HTRA1 variante que comprende una variación en una región no codificante como se describe, en una muestra obtenida del individuo. Si el HTRA1 variante está presente en la muestra en menor grado después del tratamiento (que antes del tratamiento) , esto es una indicación de regresión de AMD, y que el tratamiento fue eficaz.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema que representa los genes en la región de 4 gametos en el cromosoma 10q26, así como la localización de SNPs genotipados mediante micromatrices (+) e identificados mediante secuenciación (!) . SNP rs10490924 está marcado como “8”, y rs11200638 está marcado con un asterisco.

Las Figuras 2A-B son gráficas que representan resultados obtenidos mediante PCR cuantitativa (qPCR) de ChIP DNA preparado a partir de células HeLaS3: Figura 2A AP-2∀ (línea continua) , Figura 2B SRF (línea continua) , y (Figura 2A y 2B) inmonuglobulina G de conejo normal (línea discontinua) representan las inmunoprecipitaciones analizadas. También se ensayaron promotores de control positivo y negativo. El log (#Rn) (eje y) se representa gráficamente frente al número de ciclos de PCR (eje x) . Entre paréntesis se muestra el incremento en número de veces de los valores ##Ct de la transcripción calculado con relación a las reacciones de PCR de referencia) .

La Figura 3 es una representación de un análisis computacional de la secuencia del promotor de HTRA1. Secuencias ortólogas humanas y de ratón en el promotor de HTRA1; los nucleótidos conservados están marcados con símbolo de asterisco.

La Figura 4A es una gráfica que representa los valores de log P (eje y) de análisis de asociación para los 15 SNPs en la región de AMD 10q usando 442 casos de AMD y 309 controles (véase también la tabla 2) . Para los rs10490924 (cuadrado) y rs11200638 (triángulo) , las asociaciones se derivaron de un tamaño de muestras más grande (581 casos de AMD) .

La Figura 4B es una gráfica de barras que representa los resultados obtenidos mediante análisis semicuantitativo mediante RT-PCR en tiempo real de niveles de ARN de HTRA1 en linfocitos de la sangre procedente de tres pacientes con AMD con el genotipo AA y tres controles normales con el genotipo GG. La significancia estadística de las diferencias en el nivel de expresión se examinó usando una prueba de la t de muestras independientes (SPSS versión 13.0) : AA:GG (P=0, 02) . Las barras de error indican el intervalo de confianza de 95, 0% de la media.

Descripción detallada de la invención

El descubrimiento de que una variación en la región no codificante del gen de HTRA1 está asociada con AMD es útil para el diagnóstico y tratamiento de individuos, tales... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para identificar o ayudar a identificar un individuo que sufre o tiene riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad, para diagnosticar o ayudar a diagnosticar degeneración macular relacionada con la edad en un individuo, o para evaluar el riesgo de progresión de degeneración macular relacionada con la edad en un

individuo, que comprende:

(I) ensayar una muestra obtenida del individuo en busca de la presencia de una base nucleotídica distinta de una G en la posición 29 en SEC ID No: 69 del gen de HTRA1 humano, en el que la presencia de una base nucleotídica distinta de una G en dicha posición del gen de HTRA1 variante indica que el individuo sufre o tiene riesgo de desarrollar o de progresión de degeneración macular relacionada con la edad; o

10 (II)

(a) combinar una muestra del individuo con una sonda polinucleotídica que se hibrida, en condiciones restrictivas, a una variación en la región reguladora no codificante en dirección arriba de la posición +1 del sitio de iniciación de la transcripción putativo del gen de HTRA1 humano que está correlacionado con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos, pero no se

hibrida a un gen de HTRA1 de tipo salvaje, produciendo de ese modo una combinación;

(b) mantener las condiciones de combinación apropiadas para que se produzca la hibridación; y

(c) determinar si se produce la hibridación, en el que la aparición de hibridación indica que el individuo tiene riesgo de desarrollar o progresión de degeneración macular relacionada con la edad; o

(III)

(a) secuenciar una región del ADN procedente de un individuo que comprende el nucleótido en la posición 29 en SEC ID No: 69 del sitio de iniciación de la transcripción putativo del promotor del gen de HTRA1 en seres humanos; y

(b) determinar si está presente en el ADN una variación de la secuencia de tipo salvaje de la región

del promotor del gen de HTRA1, en el que la presencia de la variación indica que el individuo tiene 25 riesgo de desarrollar o progresión de degeneración macular relacionada con la edad;

siendo dicha variación una base nucleotídica distinta de una G en la posición 29 en SEC ID No: 69.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha variante corresponde a un polimorfismo de un solo nucleótido (G ∃ A) en la posición 29 en SEC ID No: 69 (rs11200638) .

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende además determinar en la muestra la presencia

o ausencia de una variación adicional en un gen que está correlacionado con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos, en el que la variación adicional es distinta de la variación en la región reguladora no codificante en dirección arriba de la posición +1 del sitio de transcripción putativo de un gen de HTRA1 humano.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la variación adicional se detecta usando una segunda sonda que se 35 hibrida a la variación adicional.

5. El método de la reivindicación 3, en el que la variación adicional se detecta usando un segundo conjunto de cebadores que se hibridan a cualquier lado de la variación adicional.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la variación adicional es la presencia de histidina en la posición 402 de la proteína de CFH humana, que corresponde al SNP rs1061170, y/o la presencia de

un aminoácido distinto de alanina en la posición 69 de la proteína humana LOC387715, por ejemplo serina, que corresponde a SNP rs10490924.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el individuo es un individuo asiático.

8. Un kit de diagnóstico para detectar un gen de HTRA1 variante en una muestra procedente de un individuo, que

comprende al menos un medio de recipiente y una etiqueta y/o instrucciones para uso en el kit de diagnóstico en la 45 detección de un gen de HTRA1 variante en una muestra, en el que dicho medio de recipiente tiene en él:

(a) una sonda polinucleotídica que se hibrida, en condiciones restrictivas, a una primera variación en la región reguladora no codificante en dirección arriba de la posición +1 del sitio de transcripción putativo del gen de HTRA1 humano que está correlacionado con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos; o

(b) una sonda polinucleotídica que se hibrida, en condiciones restrictivas, adyacente a un lado de una variación en la posición 29 en SEC ID No: 69 de la región de promotor del gen de HTRA1 humano que está correlacionado con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos, y opcionalmente un segundo cebador polinucleotídico que se hibrida, en condiciones restrictivas, al otro lado de

la variación en la posición 29 en SEC ID No: 69;

en el que el kit comprende además una segunda sonda o par de cebadores que detecta en la muestra la presencia o ausencia de una variación adicional que está correlacionada con la aparición de degeneración macular relacionada con la edad en seres humanos, y en el que dicha primera variación es una base nucleotídica distinta de una G en la posición 29 en SEC ID No: 69, y dicha variación adicional es la presencia de histidina en la posición 402 de la

proteína de CFH humana, correspondiente al SNP rs 1061170 y/o la presencia de un aminoácido distinto de alanina en la posición 69 de la proteína LOC387715, por ejemplo serina, que corresponde a SNP rs10490924.

9. Una composición para uso en un método para tratar degeneración macular relacionada con la edad, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo biespecífico, monocatenario, quimérico, humanizado o humano que se une al polipéptido de HTRA1, o un anticuerpo específicamente reactivo con el

polipéptido de HTRA1, en la que la unión del anticuerpo al polipéptido de HTRA1 reduce la actividad del polipéptido de HTRA1.


 

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