Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina(FGE).

Método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Cα

-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de C- formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.

Diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas y otras usando una enzima generadora de formilglicina (FGE)

Esta invención se refiere, entre otras cosas, a métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) así como a otras deficiencias de sulfatasa. Más específicamente, la invención usa moléculas que modulan modificaciones postraduccionales en sulfatasas. Tales modificaciones son esenciales para una función sulfatasa apropiada.

Las sulfatasas son miembros de una familia de genes altamente conservada, que comparten una amplia homología de secuencia (Franco, B., et al., Cell, 1995, 81:15-25; Parenti, G., et al., Curr. Opin. Gen. Dev., 1997, 7:386-391) , un alto grado de similitud estructural (Bond, C.S., et al., Structure, 1997, 5:277-289; Lukatela, G., et al., Biochemistr y , 1998, 37:3654-64) , y una modificación postraduccional única que es esencial para la escisión del éster de sulfato (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82: 271-278; Selmer, T., et al., Eur. J. Biochem., 1996, 238:341-345) . La modificación postraduccional implica la oxidación de un residuo conservado de cisteína (en eucariotas) o serina (en determinadas procariotas) , en Cp, proporcionando L-Ca-formilglicina (también conocida como FGly; ácido 2-amino-3ºxopropanoico) en el que un grupo aldehído sustituye al grupo tiometilo de la cadena lateral. El aldehído es una parte esencial del sitio catalítico de la sulfatasa y probablemente actúa como hidrato de aldehído. Uno de los grupos hidroxilo geminales acepta el sulfato durante la escisión del éster de sulfato conduciendo a la formación de un producto intermedio de enzima covalentemente sulfatada. El otro hidroxilo se requiere para la eliminación posterior del sulfato y regeneración del grupo aldehído. Esta modificación se produce en el retículo endoplasmático durante, o poco después de, la importación del polipéptido de sulfatasa naciente y se dirige por una secuencia lineal corta que rodea al residuo de cisteína (o serina) que va a modificarse. Esta secuencia altamente conservada es el hexapéptido L/V-C (S) -X-P-S-R (SEQ ID NO: 32) , presente en la región N-terminal de todas las sulfatasas eucariotas y lo más frecuentemente lleva un grupo hidroxilo o tiol en el residuo X (Dierks, T., et al., Proc. NatL Acad Sci. U. S. A., 1997, 94:11963-11968) .

Hasta la fecha se han identificado trece genes de sulfatasa en seres humanos. Codifican para enzimas con diferente especificidad de sustrato y ubicación subcelular tales como lisosomas, aparato de golgi y RE. Cuatro de esos genes, ARSC, ARSD, ARSE y ARSF, que codifican para arilsulfatasa C, D, E y F, respectivamente, se encuentran ubicados dentro de la misma región cromosómica (Xp22.3) . Comparten una similitud de secuencia significativa y una organización genómica casi idéntica, lo que indica que surgen de eventos de duplicación que se produjeron recientemente durante la evolución (Franco B, et al., Cell, 1995, 81:15-25; Meroni G, et al., Hum Mol Genet, 1996, 5:423-31) .

La importancia de las sulfatasas en el metabolismo de seres humanos se ve destacada por la identificación de al menos ocho enfermedades monogénicas humanas provocadas por la deficiencia de actividades sulfatasa individuales. La mayoría de estos estados son trastornos de almacenamiento lisosomal en los que las consecuencias fenotípicas se derivan del tipo y la distribución tisular del material almacenado. Entre ellos hay cinco tipos diferentes de mucopolisacaridosis (tipos II, IIIA, IIID, IVA y VI de MPS) debido a deficiencias de sulfatasas que actúan sobre el catabolismo de glicosaminoglicanos (Neufeld y Muenzer, 2001, The mucopolysaccharidoses, en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle, B. Childs, K.W. Kinzler y B. Vogelstein, eds. Nueva York: Mc Graw-Hill, págs. 3421-3452) , y leucodistrofia metacromática (MLD) , que se caracteriza por el almacenamiento de sulfolípidos en los sistemas nerviosos central y periférico conduciendo a deterioro neurológico grave y progresivo. Dos enfermedades humanas adicionales están provocadas por deficiencias de sulfatasas no lisosomales. Incluyen ictiosis ligada al cromosoma X, un trastorno cutáneo debido a deficiencia de sulfatasa esteroidea (STS/ARSC) , y condrodisplasia punctata, un trastorno que afecta a los huesos y cartílagos debido a deficiencia de arilsulfatasa E (ARSE) . Las sulfatasas también están implicadas en síndromes de malformación humanos inducidos por fármacos, tales como embriopatía por warfarina, provocada por la inhibición de la actividad ARSE debido a la exposición in utero a warfarina durante el embarazo.

En un trastorno monogénico humano intrigante, la deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) , todas las actividades sulfatasa son defectuosas simultáneamente. Por consiguiente, el fenotipo de esta enfermedad multisistémica grave combina las características observadas en deficiencias de sulfatasas individuales. Las células de pacientes con MSD son deficientes en cuanto a actividades sulfatasa incluso tras la transfección con ADNc que codifican para sulfatasas humanas, lo que sugiere la presencia de un mecanismo común requerido para la actividad de todas las sulfatasas (Rommerskirch y von Figura, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89:2561-2565) . Se encontró que la modificación postraduccional de sulfatasas era defectuosa en un paciente con MSD, lo que sugiere que este trastorno está provocado por una mutación en un gen, o genes, implicado en la maquinaria de conversión de cisteína en formilglicina (Schmidt, B., et al., Cell, 1995, 82:271-278) . A pesar del intenso interés biológico y médico, los esfuerzos dirigidos a la identificación de este/estos gen (es) se han visto dificultados por la poca frecuencia de pacientes con MSD y la consiguiente falta de casos familiares adecuados para realizar un mapeo genético.

Esta invención proporciona métodos y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas (MIM 272200) , y el tratamiento de otras deficiencias de sulfatasa. Más específicamente, se ha identificado un gen que codifica para la enzima generadora de formilglicina (FGE) , una enzima responsable de la modificación postraduccional única que se produce en sulfatasas que es esencial para la función sulfatasa (formación de L-Ca formilglicina; también conocida como FGly y/o ácido 2-amino-3-oxopropanoico) . Se ha descubierto, inesperadamente, que mutaciones en el gen de FGE conducen al desarrollo de deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) en sujetos. También se ha descubierto, inesperadamente, que la FGE potencia la actividad de sulfatasas, incluyendo, pero sin limitarse a, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, Nacetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3. HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6. A la vista de estos descubrimientos, las moléculas de la presente invención pueden usarse en el diagnóstico y tratamiento de deficiencia múltiple de sulfatasas así como otras deficiencias de sulfatasa.

La invención proporciona un método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de Ca-formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en aminoácidos 34-374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.

Proporciona además un método para identificar un agente útil en la modulación de la actividad de generación de Ca formilglicina, que comprende:

(a) poner en contacto una molécula que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina con un agente candidato,

(b) medir la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, y

(c) comparar la actividad medida de generación de Ca-formilglicina de la molécula con un control para determinar si el agente candidato modula la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula;

en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o es un producto de expresión de la misma.

También proporciona un método para determinar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto caracterizada por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico o un producto de expresión de la misma, que comprende:

monitorizar... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar el nivel de expresión de enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) en un sujeto, comprendiendo el método medir in vitro en una muestra obtenida de un sujeto la actividad de generación de Ca formilglicina de un péptido o polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácido.

3. 374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.

2. Método para identificar un agente útil en la modulación de la actividad de generación de Ca-formilglicina, que comprende:

(a) poner en contacto una molécula que tiene actividad de generación de Ca-formilglicina o una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula con dicha actividad con un agente candidato,

(b) medir la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula, y

(c) comparar la actividad de generación de Ca-formilglicina medida de la molécula con un control para determinar si el agente candidato modula la actividad de generación de Ca-formilglicina de la molécula;

en el que la molécula es una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o es un producto de expresión de la misma.

3. Método para determinar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto caracterizada por una expresión aberrante de una molécula de ácido nucleico o un producto de expresión de la misma, que comprende:

monitorizar una muestra de un paciente para detectar un parámetro seleccionado del grupo que consiste en:

(i) una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1,

(ii) un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico,

(iii) un péptido derivado del polipéptido, y (iv) un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido o péptido, como determinación de una deficiencia de sulfatasa en el sujeto.

4. Método según la reivindicación 3, en el que la muestra es un líquido biológico o un tejido.

5. Método según la reivindicación 3, en el que la etapa de monitorizar comprende poner en contacto la muestra con un agente detectable seleccionado del grupo que consiste en

(a) una molécula de ácido nucleico que se hibrida selectivamente en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de (i) ,

(b) un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de (ii) , o el péptido de (iii) , y

(c) un polipéptido o péptido que se une al anticuerpo de (iv) .

6. Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo, el polipéptido, el péptido o el ácido nucleico se marca con un marcador radioactivo o una enzima.

7. Método según la reivindicación 3, que comprende someter a ensayo la muestra para detectar el péptido.

8. Kit, que comprende un envase que contiene un agente y un control; en el que el agente es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une selectivamente a un péptido o polipéptido según la reivindicación 1, o es un ácido nucleico que se une selectivamente a un ácido nucleico que codifica para dicho péptido o polipéptido; y en el que el control es para comparar un valor medido de unión de dicho agente a dicho péptido, polipéptido o ácido nucleico.

9. Kit según la reivindicación 8; en el que el control es un valor predeterminado para compararlo con el valor medido.

10. Kit según la reivindicación 8; en el que el control comprende un epítopo del péptido o polipéptido.

11. Uso de una molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que modula la actividad de generación de Ca formilglicina en la preparación de un medicamento para tratar una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; en el que:

(i) la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una molécula de ácido nucleico de hibridación que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula que consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 1, o un complemento de dicha molécula de hibridación que codifica para un polipéptido que tiene actividad FGE;

(b) una molécula de ácido nucleico que se diferencia de una molécula de ácido nucleico de (a) debido a la degeneración del código genético; y

(c) un ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 3, 4, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 .

8. 87; y

(ii) el péptido o el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un péptido o un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente; y

(b) un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 34374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.

12. Uso según la reivindicación 11; en el que el medicamento comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de ácido nucleico que codifica para iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, Nacetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 o HSulf-6; un producto de expresión de la molécula de ácido nucleico; y un fragmento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico.

13. Uso según la reivindicación 11; en el que el agente que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina se produce mediante una célula que expresa dicha molécula de ácido nucleico.

14. Uso según la reivindicación 13; en el que la célula expresa una molécula de ácido nucleico de FGE exógena.

15. Uso según la reivindicación 13, en el que la célula expresa una molécula de ácido nucleico de FGE endógena.

16. Molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido que modula la actividad de generación de Ca-formilglicina; para su uso en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa en un sujeto; siendo la molécula de ácido nucleico, péptido o polipéptido según la reivindicación 11.

17. Composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico, péptido, o polipéptido según la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Método para identificar un agente candidato útil en el tratamiento de una deficiencia de sulfatasa, que comprende:

determinar la expresión de un conjunto de moléculas de ácido nucleico in vitro en una célula o tejido en condiciones que, en ausencia de un agente candidato, permiten una primera cantidad de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico; en el que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una molécula de ácido nucleico que es una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11;

poner en contacto la célula o tejido con el agente candidato in vitro, y detectar una cantidad de prueba de expresión del conjunto de moléculas de ácido nucleico;

en el que un aumento en la cantidad de prueba de expresión en presencia del agente candidato con respecto a la primera cantidad de expresión indica que el agente candidato es útil en el tratamiento de la deficiencia de sulfatasa.

19. Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida que consiste en un conjunto de moléculas de ácido nucleico, productos de expresión de las mismas, o fragmentos de los mismos, cuando se fija a un sustrato sólido; codificando cada molécula de ácido nucleico para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aminoácido.

3. 374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.

20. Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19, que comprende además al menos una molécula de ácido nucleico de control.

21. Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19; en la que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: aminoácido.

3. 374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.

22. Matriz de moléculas de ácido nucleico en fase sólida según la reivindicación 19; en la que el conjunto de moléculas de ácido nucleico comprende al menos dos moléculas de ácido nucleico, codificando cada molécula de ácido nucleico para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: aminoácido.

3. 374 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, 5, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, iduronato 2-sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.

23. Alelo variante aislado de un gen de FGE humana que codifica para un polipéptido de FGE variante, comprendiendo el polipéptido: una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o una combinación de las mismas.

24. Polipéptido de FGE humana variante aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una variación en la SEQ ID NO: 2, en el que la al menos una variación comprende: Met1Arg; Met1Val; Ser155Pro; Cys218Tyr; Ala279Val; Arg327Stop; Cys336Arg; Arg345Cys; Arg349Trp; Arg349Gln; Ser359Stop; o a combinación de las mismas.

25. Anticuerpo que tiene el polipéptido de FGE humana variante según la reivindicación 23 como inmunógeno.

26. Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo policlonal.

27. Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo monoclonal.

28. Anticuerpo según la reivindicación 25, que es un anticuerpo quimérico.

29. Anticuerpo según la reivindicación 25, marcado de manera detectable.

30. Anticuerpo según la reivindicación 29, en el que dicho marcador detectable comprende un elemento radioactivo, un compuesto químico que fluoresce o una enzima.

31. Método de producción de una sulfatasa activada, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la sulfatasa con una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) in vitro; en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido según la reivindicación 1; o

(b) proporcionar una célula que coexpresa una sulfatasa y una enzima generadora de Ca-formilglicina (FGE) de modo que se produce sulfatasa activada dentro de la célula; en el que la célula comprende ARN o ADN heterólogo que da como resultado una expresión aumentada de la sulfatasa activada, con respecto a lo que se produciría en ausencia del ARN o ADN heterólogo; y en el que la enzima generadora de Ca-formilglicina es un polipéptido o péptido según la reivindicación 1.

32. Método según la reivindicación 31, en el que la sulfatasa se selecciona del grupo que consiste en iduronato 2sulfatasa, sulfamidasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, arilsulfatasa C, arilsulfatasa D, arilsulfatasa E, arilsulfatasa F, arilsulfatasa G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf3, HSulf-4, HSulf-5 y HSulf-6.

33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 ó 18, o uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16; en el que la deficiencia de sulfatasa a la que se hace referencia con respecto a dicho método o uso se selecciona del grupo que consiste en: deficiencia múltiple de sulfatasas, mucopolisacaridosis II, mucopolisacaridosis IIIA, mucopolisacaridosis IVA, mucopolisacaridosis VI, mucopolisacaridosis VIII, leucodistrofia metacromática, condrodisplasia punctata I recesiva ligada al cromosoma X e ictiosis ligada al cromosoma X.