Diagnostico prenatal no invasivo.

La invención se refiere a un procedimiento de detección realizado en una muestra de suero o plasma materno de una mujer embarazada,

comprendiendo dicho procedimiento detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la muestra. La invención posibilita diagnósticos prenatales no invasivos, incluyendo por ejemplo la determinación del sexo, la tipificación de la sangre y otras genotipificaciones, y la detección de preeclampsia en la madre.

Diagnostico prenatal no invasivo.

Esta invención se refiere a métodos de detección prenatal en los que se utilizan técnicas no invasivas. En particular, se refiere a la diagnosis prenatal mediante la detección de ácidos nucleicos fetales en el suero o plasma de una muestra de sangre materna.

En los métodos de rastreo prenatal convencionales para detectar anomalías fetales y para la determinación del sexo se utilizan tradicionalmente muestras fetales derivadas de técnicas invasivas tales como la amniocentesis y la toma de muestras del vello coriónico. Estas técnicas requieren una manipulación cuidadosa y presentan un grado de riesgo para la madre y el embarazo.

Más recientemente, se han ideado técnicas para predecir las anomalías en el feto y posibles complicaciones en el embarazo, en las que se utilizan muestras de sangre o suero maternas. Entre los tres marcadores comúnmente utilizados se incluyen la alfa-fetoproteína (AFP -de origen fetal) , la gonadotropina coriónica humana (hCG) y el estriol, para rastrear el Síndrome de Down y los defectos del tubo neural. El suero materno también es utilizado en la actualidad para el rastreo bioquímico de aneuploidías cromosómicas y defectos del tubo neural. El paso de células nucleadas entre la madre y el feto es ahora un fenómeno bien reconocido Lo y col 1.989; Lo y col 1.996) . El uso de células fetales en la sangre materna para la diagnosis prenatal no invasiva (Simpson y Elias 1.993) evita los riesgos asociados a las técnicas invasivas convencionales. En WO 91/08304 se describe la determinación genética prenatal utilizando ADN fetal obtenido a partir de células fetales de la sangre materna. Se han realizado considerables avances en el enriquecimiento y aislamiento de células fetales para su análisis (Simpson y Elias 1.993; Cheung y col. 1.996) . Sin embargo, estas técnicas llevan mucho tiempo o requieren un equipo costoso.

Recientemente, ha habido interés en el uso de ADN derivado de plasma o suero para la diagnosis molecular (Mulcahy y col. 1.996) . En particular, se ha demostrado que se puede detectar ADN tumoral por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el plasma o suero de algunos pacientes (Chen y col. 1.996; Nawroz y col. 1.996) .

En GB 2.299.166 se describe la diagnosis de cáncer no invasiva mediante la detección de las mutaciones del gen Kras y N-ras utilizando mecanismos basados en la PCR.

Se ha descubierto que el ADN fetal es detectable en muestras de suero o plasma maternas. Este es un descubrimiento sorprendente e inesperado; el plasma materno es precisamente el material que es descartado rutinariamente por los investigadores que estudian la diagnosis prenatal no invasiva utilizando las células fetales de la sangre materna. La tasa de detección es muy superior utilizando suero o plasma que utilizando ADN de células sanguíneas nucleadas extraídas de un volumen comparable de sangre completa, sugiriendo que existe un enriquecimiento de ADN fetal en el plasma y el suero maternos. De hecho, se ha medido una concentración de ADN fetal en el plasma materno expresada como un % del ADN total desde el 0, 39% (la concentración más baja medida en el inicio del embarazo) , hasta tan alta como el 11, 4% (al final del embarazo) , en comparación con proporciones de generalmente alrededor del 0, 001% y hasta sólo el 0, 025% para las fracciones celulares (Hamada y col. 1.993) . Es importante que el ADN fetal no sea un artefacto del procedimiento de coagulación.

La invención proporciona un método de detección realizado sobre una muestra de suero o plasma de ADN materna de una hembra embarazada, cuyo método comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la muestra, donde dicho ácido nucleico es heredado por vía paterna, secuencia que no es poseída por dicha hembra embarazada. La detección puede comprender la cuantificación del ácido nucleico o la determinación de la secuencia del ácido nucleico. La invención proporciona de este modo un método para la diagnosis prenatal.

El término "diagnosis prenatal" utilizado aquí abarca la determinación de cualquier estado o característica materna o fetal que esté relacionado con el propio ADN fetal o con la cantidad o calidad del ADN fetal en el suero o plasma materno. Se incluyen la determinación del sexo, y la detección de las anomalías fetales que pueden ser por ejemplo aneuploidías cromosómicas o simples mutaciones. También está incluida la detección y la verificación de los estados asociados con el embarazo tales como la preclampsia que produce cantidades más altas o más bajas que las normales de ADN fetal presente en el suero o plasma materno. El ácido nucleico detectado en el método según la invención puede ser de un tipo distinto al ADN v.g. ARNm.

La invención proporciona un método para realizar una diagnosis prenatal sobre una muestra de sangre materna, cuyo método comprende obtener una fracción no celular de la muestra de sangre y realizar un análisis de ácido nucleico de la fracción para detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la muestra, donde dicha secuencia es heredada por vía paterna, secuencia que no es poseída por la madre. Un método de realización de una diagnosis prenatal de una detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la muestra de sangre materna según la invención puede comprender eliminar todas o sustancialmente todas las poblaciones de células nucleadas y anucleadas de la muestra de sangre y someter el fluido restante a una prueba de ácido nucleico fetal indicativo de un estado o característica materna o fetal.

Un método de realización de la diagnosis prenatal, comprende típicamente:

(i) proporcionar una muestra de sangre materna;

(ii) separar la muestra en una fracción celular y una no celular;

(iii) detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la fracción no celular utilizando un método de detección de la invención;

(iv) proporcionar una diagnosis basada en la presencia y/o cantidad y/o secuencia del ácido nucleico fetal.

La fracción no celular utilizada en la etapa (iii) puede ser una fracción de plasma. En el método se puede incluir adicionalmente la realización de una etapa adicional en la que se permite la coagulación de la sangre materna y se utiliza el suero resultante en la etapa (iii) .

La muestra de suero o plasma materno deriva de la sangre materna. Se puede utilizar tan poco como 10 μl de suero o plasma. Sin embargo puede ser preferible emplear muestras más grandes con el fin de incrementar la precisión. El volumen de muestra requerido puede depender del estado o característica que esté siendo detectado. En cualquier caso, el volumen de sangre materna que se necesita tomar es pequeño.

La preparación de suero o plasma a partir de la muestra de sangre materna se lleva a cabo mediante mecanismos normalizados. El suero o plasma es sometido normalmente después a un procedimiento de extracción de ácido nucleico. Entre los métodos adecuados se incluyen los métodos descritos aquí en los ejemplos, y las variaciones de esos métodos. Entre las posibles alternativas se incluyen el método del calentamiento controlado descrito por Frickhofen y Young (1.991) . Otro método de extracción de suero y plasma adecuado es el tratamiento con proteinasa K seguido de extracción con fenol/cloroformo. Los métodos de extracción de ácido nucleico de suero y plasma que permiten la purificación de ADN o ARN a partir de volúmenes más grandes de muestra materna aumentan la cantidad de material de ácido nucleico fetal para el análisis y de este modo mejoran la precisión. Un método de enriquecimiento basado en la secuencia también se podría utilizar sobre el suero o plasma materno para enriquecer específicamente en secuencias de ácido nucleico fetal.

Se puede llevar a cabo típicamente un método según la invención en el que la muestra de suero o plasma materno contiene ADN fetal a una concentración fraccionada de al menos aproximadamente el 0, 14%, tal como al menos el 0, 39%, sin someterlo a una etapa de enriquecimiento de ADN fetal.

Normalmente se lleva a cabo una amplificación de las secuencias de ADN fetal de la muestra. Se pueden utilizar sistemas de amplificación de ácido nucleico normalizados, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la reacción en cadena de la ligasa, la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) , los métodos de ADN ramificado, etcétera. Los métodos de amplificación preferidos... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección realizado sobre una muestra de plasma o suero materno de una hembra embarazada, cuyo método comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la muestra, donde dicho ácido 5 nucleico es heredado por vía paterna, secuencia que no es poseída por dicha hembra embarazada.

2. Un método según la reivindicación 1, donde dicha detección comprende cuantificar dicho ácido nucleico.

3. Un método según la reivindicación 1, donde dicha detección comprende detectar la presencia de una secuencia 10 de ácido nucleico.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha detección comprende amplificar dicho ácido nucleico.

5. Un método según la reivindicación 4, donde dicha amplificación es mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

6. Un método según la reivindicación 4 o 5, donde en dicha amplificación se utiliza al menos un cebador oligonucleotídico específico de la secuencia fetal. 20

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde se detecta la presencia de una secuencia de ácido nucleico fetal del cromosoma Y.

8.Un método según la reivindicación 7 para determinar el sexo del feto.

9.Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde dicho ácido nucleico es de un cromosoma distinto de Y heredado por vía paterna.

10. Un método según la reivindicación 9, donde dicho ácido nucleico es el gen Rhesus D.

11. Un método según la reivindicación 10 para el genotipaje Rhesus D de un feto en una madre Rhesus D-negativa.

12. Un método según la reivindicación 2, que comprende determinar la concentración de la secuencia de ácido 35 nucleico fetal en el suero o plasma materno.

13. Un método según la reivindicación 12, donde dicha determinación es mediante PCR cuantitativa.

14. Un método según la reivindicación 12 o 13, para 40 la detección de una afección materna o fetal en la que el nivel de ADN fetal en suero o plasma materno es más alto

o más bajo que el normal.

15. Un método según la reivindicación 14, para la detección de la pre-eclampsia.

16. Un método según la reivindicación 14, para la detección de una aneuploidía cromosómica fetal.

17. Un método según la reivindicación 16, donde dicha aneuploidía cromosómica fetal es el Síndrome de Down.

50 18. Un método de realización de una diagnosis prenatal, cuyo método comprende:

(i) separar una muestra de sangre prenatal en una fracción celular y no celular;

(ii) detectar la presencia de un ácido nucleico de origen fetal en la fracción no celular utilizando el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17; y

(iii) proporcionar una diagnosis basada en la presencia y/o cantidad y/o secuencia del ácido nucleico fetal. 55

19. Un método según la reivindicación 18, donde dicha fracción no celular utilizada en la etapa (iii) es una fracción de plasma.

FIG. 4 FIG. 4 (Cont.)