DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER POR ANALISIS DE POLIMORFISMOS DEL GEN IL-10.

Un método para determinar la existencia de una predisposición a la enfermedad de Alzheimer,

comprendiendo el método analizar in vitro una muestra que lleva ADN tomada a partir de un sujeto animal para determinar las variantes alélicas presentes en uno o más de los loci de SNP en las posiciones -1082, -819 y -592 del gen que codifica IL-10

Diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer por análilsis de polimorfismos del gen IL-10.

Esta invención se refiere al uso de IL-10 en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

La causa principal del deterioro cognitivo en los ancianos es la enfermedad de Alzheimer (AD). Debido al aumento de la duración de la vida en todo el mundo, se espera que se triplique el número de personas afectadas por AD durante los próximos 50 años (1). La AD es un síndrome clínico caracterizado por mecanismos patógenos complejos y heterogéneos. Los factores genéticos reconocidos incluyen mutaciones del gen que codifica la proteína precursora de amiloide (2), y la presenilina 1 y 2 (3, 4), que son las responsables de una pequeña parte de los casos de AD familiares y normalmente de inicio prematuro. También se han asociado factores genéticos con la forma esporádica o no familiar de la enfermedad y el alelo e4 de la apolipoproteína E (Apo E) aumenta significativamente el riesgo de AD, pero no es necesario ni suficiente para el desarrollo de la enfermedad (5-7). Por lo tanto, es probable que estén implicados otros factores genéticos y ambientales y se investigarán activamente.

Las moléculas que intervienen en la cascada inflamatoria tienen un gran interés debido a que se ha sugerido repetidamente que la inflamación está asociada con el proceso neurodegenerativo característico del cerebro con AD (8). De esta manera, se observa astrocitosis reactiva tanto en la corteza como en el hipocampo de estos pacientes y las células gliales también están activadas dentro o cerca de las placas neuríticas. Un exceso de expresión de citocinas y otras moléculas inflamatorias son características comunes de la patología del cerebro con AD (9). Además, los estudios epidemiológicos demostraron que el uso a largo plazo de antiinflamatorios no esteroideos está asociado con una reducción de la incidencia de AD en un estudio de control en gemelos siameses (10) y otros diversos estudios clínicos confirmaron una menor asociación de AD en individuos tratados con antiinflamatorios (11), incluyendo inhibidores específicos de COX2 (12). Estos descubrimientos confirman la hipótesis de que la inflamación podría contribuir a la neurodegeneración asociada con la AD (13).

Con la intención de entender mejor la biología de la AD, recientemente se ha investigado el posible papel de varias citocinas y quimioquinas. Se ha sugerido que prácticamente todos los mediadores analizados en estos estudios, incluyendo IL-1b, IL-6, TNF-a, IL-8, TGF-ß y la proteína-1a inflamatoria de macrófagos (MIP-1a), están regulados positivamente en la AD en comparación con controles sin demencia (14-18). Por el contrario, se obtienen resultados conflictivos en relación con la citocina inmunomoduladora IL-10, una citocina de tipo 2 que reprime a los linfocitos T y la inmunidad mediada por células en seres humanos y ratones y tiene potentes propiedades antiinflamatorias (19-21).

Estos estudios consideraron cada citocina independientemente como polimorfismos génicos y/o producción, pero nunca investigaron la relación entre factores que actúan a favor y en contra de la inflamación, tales como la IL-10 y la IL-6 en la misma muestra de población.

Merece la pena recordar que se conocen polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora de estos dos genes. El gen que codifica IL-10, localizado en el cromosoma 1 entre 1q31 y 1q32, es muy polimórfico. La producción de IL-10 está correlacionada con polimorfismos bialélicos en las posiciones: -1082 (sustitución de guanina por adenina), -819 (sustitución de timina por citosina) y -592 (sustitución de adenina por citosina). El polimorfismo en la posición -1082 está dentro de un sitio de reconocimiento de tipo Ets (específico de E-26) y puede afectar a la unión de este factor de transcripción y por lo tanto alterar la activación de la transcripción; el alelo -1082A se correlaciona con la generación de IL-10 después de la estimulación de células T in vitro (57), mientras que no parecen estar implicados polimorfismos en las posiciones -819 y -592. El gen de la IL-6 en seres humanos está organizado en cinco exones y cuatro intrones y se localiza en el brazo corto del cromosoma 7 (7p21) (50, 73). La implicación de la IL-6 en muchas funciones biológicas tiene su paralelo en asociaciones genéticas de sus variantes alélicas con varias afecciones fisiológicas y patofisiológicas. Frecuentemente se han usado dos de sus sitios polimórficos para estudios de asociación genética: un número variable multialélico de polimorfismos de repeticiones en tándem (VNTR) en la región flanqueante 3' (repeticiones AT) y un polimorfismo bialélico de G a C del promotor en la posición -174. El polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) G/C parece estar asociado con niveles sanguíneos y velocidades de transcripción variables de IL-6 (54, 56, 68).

A la luz de estas consideraciones y basándose en un estudio de asociación caso-control en pacientes italianos con AD esporádica de inicio tardío y en controles sanos (HC) equiparables, los presentes inventores evaluaron si los SNP de IL-10 e IL-6 estaban relacionados con el desarrollo de la AD. Los resultados arrojan más luz sobre la hipótesis patogénica inflamatoria de la AD y sugieren una predisposición genética independiente de la metabólica.

Estas variaciones alélicas están asociadas con diferencias medibles en la producción de IL-10 e IL-6 por linfocitos de sangre periférica estimulados por antígeno y por mitógeno. De hecho, estos polimorfismos se producen en la región reguladora del gen y están asociados con una producción elevada, intermedia o baja de IL-10 (22).

Los presentes inventores investigaron la producción de IL-10 e IL-6 estimulada por beta amiloide por linfocitos de sangre periférica (PBMC) de pacientes con AD y de controles sanos de edades equiparables. Como la generación de esta citocina estaba significativamente reducida en los pacientes con AD, se analizaron los polimorfismos de IL-10 en estos mismos individuos. Los resultados demostraron que el alelo de alta producción de IL-10 es extremadamente raro en los pacientes con AD.

Específicamente, los genotipos de IL-10 están distribuidos de diferente forma cuando la AD se compara con HC (?² = 16,007; p = 0,007). Por lo tanto, los genotipos correspondientes a una producción reducida de IL-10 tienen una distribución significativamente mayor entre los sujetos con AD (tabla I). La presencia de genotipos con baja producción de IL-10 está asociada con un peor resultado clínico de AD entendido como se indica a continuación: 1) menor edad de inicio de la enfermedad (tabla II); y 2) progresión más rápida de la enfermedad (puntuación del MMSE) (tabla III).

Las frecuencias de los diferentes genotipos entre los pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) son estadísticamente diferentes de las de los controles sanos (HC). ?² = 16,700, df = 5, p = 0,007. Entre paréntesis, (c), se proporcionan los correspondientes fenotipos de producción alta (H), intermedia (M) y baja (L).

Correlación entre los diferentes genotipos en pacientes con enfermedad de Alzheimer y la edad de inicio. ANOVA: p = 0,042.

Correlación entre los diferentes genotipos en pacientes con enfermedad de Alzheimer y ANOVA de MMSE: p = 0,010.

Se sugiere que la inflamación crónica está implicada en el proceso neurodegenerativo característico de la AD (24, 25); esta sugerencia procede de los criterios tanto in vivo como ex adjuvantibus. De esta manera, se observa que los mediadores inflamatorios y las células gliales activadas están muy asociados con las placas neuríticas in vivo. Además, ciertos datos recientes indican que la terapia antiinflamatoria podría ser útil en la modulación de la progresión de la enfermedad (10-12). A pesar de esta gran cantidad de evidencias, las correlaciones biológicas de la AD aún no están claras. Para...

1. Un método para determinar la existencia de una predisposición a la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método analizar in vitro una muestra que lleva ADN tomada a partir de un sujeto animal para determinar las variantes alélicas presentes en uno o más de los loci de SNP en las posiciones -1082, -819 y -592 del gen que codifica IL-10.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se determina el genotipo en las tres posiciones -1082, -819 y -592.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además analizar la muestra para determinar los alelos presentes para los genes que codifican IL-6 y ApoE.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además analizar la muestra para determinar los alelos presentes para el gen que codifica IL-1.

5. Uso de los fragmentos de ADN o ADNc que codifican el gen de IL-10 y que comprenden los polimorfismos alélicos GCC/GCC, GCC/ACC, GCC/ATA, ACC/ACC, ACC/ATA y ATA/ATA en un método de exploración de compuestos con respecto a su capacidad de modular o prevenir la enfermedad de Alzheimer.