Un método para la determinación simultánea de actividad inhibitoria de la proliferación celular y de toxicidad celular de un compuesto químico de bajo peso molecular utilizando una muestra de células de mamífero en proliferación como sistema control,

que se caracteriza por

a) tratar dicha muestra de células que es una suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas diferentes;

b) tratar dicha muestra de células con un primera tinción de colorante fluorescente específica de las células muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda tinción de colorante fluorescente de todas las células;

c) añadir a dicha muestra de células una cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 µm a dicho volumen y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer colorante fluorescente;

d) determinar la proporción entre la cantidad de células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha muestra;

e) determinar, con los resultados del paso d) y mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el número de células muertas o viables mediante la luz fluorescente emitida por dicho primer colorante fluorescente a una primera longitud de onda, el número de células totales por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante fluorescente a una segunda longitud de onda, el número de partículas de látex por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un segundo ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho tercer colorante fluorescente a una tercera longitud de onda;

f) y determinar con los resultados de los pasos d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad de dicho compuesto

Determinación simultánea de la actividad inhibitoria de la proliferación celular y la toxicidad utilizando citometría de flujo.

La invención proporciona un método para la determinación simultánea de la actividad inhibitoria de la proliferación celular y la toxicidad de una sustancia que puede realizarse mientras se realiza un cribado de la actividad de tal sustancia en la inhibición de la proliferación.

Antecedentes de la invención

La identificación de sustancias que son potentes inhibidores de la proliferación es de gran importancia en el descubrimiento de fármacos, especialmente en el área de la oncología. Existe una variedad de ensayos in vitro basados en células para la investigación de los efectos antiproliferativos de tales sustancias candidatas. Ejemplos de tales ensayos son, por ejemplo, el ensayo colorimétrico MTT, el ensayo de captación de timidina [³H], y el ensayo WST (Johnston, P., en: Cellular Assays in HTS, Methods in Molecular Biology, Vol. 110, Janzen W.P. (Ed.), Humana Press, NJ, págs. 107-116; Bellamy, W.T., Drugs 44 (1992) 690-708). Respecto al desarrollo de fármacos, es necesario que tales ensayos puedan utilizarse en un cribado de alta eficiencia de un gran número de potenciales fármacos candidatos.

Para la determinación del estado de proliferación de las células hematopoyéticas, normalmente se pone en contacto la población celular con la sustancia en investigación y un reactivo capaz de generar luminiscencia en presencia de ATP y se detecta la luminiscencia como medida del estado de proliferación (US 2002/0146680). En la patente estadounidense Nº 5.972.639 se describe un ensayo para determinar el número de células en un cultivo celular mediante una medida de fluorescencia.

Sin embargo, tales ensayos son costosos en tiempo, proporcionan sólo resultados limitados, y no discriminan entre la inhibición de la proliferación y la inducción de muerte celular.

Por lo tanto, existe la necesidad de un ensayo que permita la determinación de la influencia de una sustancia sobre la proliferación y sobre la inducción de muerte celular de forma simple y simultánea. Además, existe la necesidad de que tales ensayos puedan realizarse de forma automática.

Chandrasekaran et al. (1995. Canc Chemother Pharmacol, 35, 489-495) describen la determinación mediante citometría de flujo del efecto citostático y citotóxico de la 3'-azido-3'-desoxitimidina. La distinción entre la citostasis y la citotoxicidad se realiza mediante experimentos adicionales que involucran entre otros la de incorporación BdRD. Dos muestras separadas se procesan separadamente.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para la determinación simultánea de la actividad inhibitoria de la proliferación celular y de la toxicidad celular (inducción de muerte celular) de un compuesto químico de bajo peso molecular utilizando una muestra de células de mamífero en proliferación como sistema control, que se caracteriza por

a) tratar dicha muestra de células que es una suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas diferentes;

b) tratar dicha muestra de células con un primera tinción de colorante fluorescente específicamente de las células muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda tinción de colorante fluorescente de todas las células;

c) añadir a dicha muestra de células una cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 µm a dicho volumen y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer colorante fluorescente;

d) determinar la proporción entre la cantidad de células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha muestra;

e) determinar, con los resultados del paso d) y mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el número de células muertas o viables por la luz fluorescente emitida por dicho primer colorante fluorescente a una primera longitud de onda, el número de células totales por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante fluorescente a una segunda longitud de onda, el número de partículas de látex por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un segundo ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho tercer colorante fluorescente a una tercera longitud de onda;

f) y determinar con los resultados de los pasos d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad de dicho compuesto.

En una realización preferible de la invención, las células muertas están teñidas específicamente con un colorante fluorescente y el número de partículas de látex y de células se mide mediante la diferencia entre luz dispersada lateral y luz dispersada hacia delante.

En una realización más preferible de la invención, las células son células progenitoras CD34+ humanas.

En una realización preferible de la invención, el método se realiza en al menos cinco concentraciones diferentes de dicha sustancia en investigación, lo que preferiblemente permite el cálculo de los valores CI₅₀ de la proliferación y de inducción de muerte celular. Preferiblemente, el rango de concentración está entre un factor de alrededor de 1 y 10.000.

Tras el tratamiento de las células con la sustancia en investigación, las células se cultivan bajo condiciones estándar que permitirían la proliferación celular. En una realización preferible de la invención, las células se cultivan en paralelo en múltiples dispositivos, preferiblemente en placas microtituladas multipocillo. Además, también se añaden las sustancias en investigación a estos dispositivos en las diferentes concentraciones, preferiblemente mediante métodos de dispensación automática.

Descripción detallada de la invención

Un crecimiento celular retrasado durante el cultivo de células en presencia de una sustancia que se sospecha es un inhibidor celular puede estar causado por muerte celular y/o inhibición de la proliferación celular. Por lo tanto, a partir de una mera determinación de la cantidad de células tras el cultivo no es posible concluir directamente la toxicidad y/o la actividad inhibitoria de la sustancia. Es necesario conocer las cantidades de células viable y muertas y su proporción respecto de la cantidad de células totales para llegar a tal conclusión. La invención proporciona un método para la determinación simultánea de estos parámetros de forma rápida. Además, el método de acuerdo con la invención puede realizarse de forma automática y por lo tanto permite una investigación a gran escala de la toxicidad y actividad inhibitoria de la proliferación de las sustancias.

De acuerdo con la invención, una alícuota definida (predeterminada) de partículas de látex se añade a cada dispositivo de cultivo celular. En base al contaje de las partículas de látex durante el análisis de citometría de flujo, puede estimarse el volumen de líquido en el que se realiza todo el contaje. Por lo tanto, la invención proporciona un método para la determinación simultánea de la cantidad de células totales por unidad de volumen (lo que es una medida de la proliferación celular) y de la cantidad de células viables por unidad de volumen tras el cultivo en presencia de una sustancia que se sospecha es un inhibidor de la proliferación y/o que es toxico para las células del sistema control. La comparación de la cantidad de células totales con la cantidad de células muertas o células viables para diferentes concentraciones de la sustancia proporciona información sobre la relación entre la inhibición de la proliferación celular y la toxicidad de la sustancia. Esto puede deducirse inmediatamente de la Fig. 3. Si el porcentaje de células muertas respecto a las células totales aumenta significativamente mientras el número de células totales disminuye, esto indica una elevada toxicidad de la sustancia. Sin embargo, si el porcentaje de células muertas respecto a las células totales no aumenta significativamente al aumentar la concentración de sustancia mientras el número de células totales disminuye, entonces la sustancia muestra una baja toxicidad. Ejemplos de sustancias con una elevada toxicidad se muestran en la Fig. 3. El 5-fluorouracilo y la doxorubicina son sustancias que muestran toxicidad en paralelo a una significativa inhibición...

1. Un método para la determinación simultánea de actividad inhibitoria de la proliferación celular y de toxicidad celular de un compuesto químico de bajo peso molecular utilizando una muestra de células de mamífero en proliferación como sistema control, que se caracteriza por

a) tratar dicha muestra de células que es una suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas diferentes;

b) tratar dicha muestra de células con un primera tinción de colorante fluorescente específica de las células muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda tinción de colorante fluorescente de todas las células;

c) añadir a dicha muestra de células una cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 µm a dicho volumen y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer colorante fluorescente;

d) determinar la proporción entre la cantidad de células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha muestra;

e) determinar, con los resultados del paso d) y mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el número de células muertas o viables mediante la luz fluorescente emitida por dicho primer colorante fluorescente a una primera longitud de onda, el número de células totales por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante fluorescente a una segunda longitud de onda, el número de partículas de látex por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un segundo ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho tercer colorante fluorescente a una tercera longitud de onda;

f) y determinar con los resultados de los pasos d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad de dicho compuesto.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque las células muertas se tiñen específicamente mediante un colorante fluorescente y el número de partículas de látex y las células se mide mediante la diferencia entre la luz dispersada lateral y la luz dispersada hacia el frente.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se caracteriza porque las células son células progenitoras CD34+ humanas.

4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3, que se caracteriza porque las células se cultivan en paralelo en múltiples dispositivos y las muestras se transfieren al instrumento de análisis mediante citometría de flujo a través de dispensación automática.