Un método para determinar in vitro la actividad de la trombina en una muestra biológica que es una muestra de sangre entera o una muestra de plasma y en el que la generación de trombina se mide por las etapas de:

- poner en contacto una capa de dicha muestra con un substrato fluorógeno de trombina y con una concentración conocida de fluoróforo en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina, y en el que dicha capa tiene un grosor dentro de un intervalo de 0,05 a 5 mm y una superficie dentro de un intervalo de 10 a 500 mm 2 , y en el que dicha muestra se introduce en un recipiente que contiene medios que ayudan a la dispersión de la muestra; - permitir que se genere trombina en dicha muestra; - medir la fluorescencia emitida desde la superficie de la capa, por el grupo fluorescente desprendido del substrato fluorógeno como resultado de la acción enzimática de la trombina generada sobre dicho substrato fluorógeno

Determinación de la actividad de trombina en sangre completa.

La invención se refiere a un método para determinar, especialmente medir la secuencia temporal de la actividad de la trombina in vitro, es decir, medir la trombina activa en una muestra, especialmente cuando se desarrolla en una muestra coagulada que consiste en sangre entera. El resultado de la medida de la actividad de la trombina se puede representar por la denominada "curva de generación de trombina" ilustrada en la figura 1.

La invención se refiere también a medios que permiten la medida de la trombina activa después de su generación en una muestra in vitro. También se refiere al uso de dicho método de medida para la detección o la monitorización del estado de un paciente, incluyendo la detección o monitorización del estado patológico relacionado con la deficiencia de la coagulación de la sangre.

La invención trata también del uso del método de medida para el examen de substancias, incluyendo el examen de fármacos que podrían interaccionar con el procedimiento de coagulación, especialmente con la actividad de la trombina.

Las enfermedades trombóticas, tales como el infarto coronario, apoplejía, embolismo pulmonar y varias otras son responsables de alrededor de la mitad de todas las muertes e invalidez en la sociedad occidental. En los países en desarrollo se incrementan con el grado de desarrollo. Las enfermedades hemorrágicas, aunque numéricamente menos importantes, son también una significativa causa de muerte. De este modo el sobre- o sub-funcionamiento del sistema hemostático es un mecanismo patógeno extremadamente importante. Es por lo tanto aún más sorprendente que no esté disponible un buen análisis de funcionamiento clínico.

El papel de la trombina en la enfermedad hemostática y trombótica

En la hemostasia y trombosis la trombina desempeña un papel fundamental. En la enfermedad trombótica venosa esto ha sido reconocido (1) desde hace mucho tiempo y está convincentemente demostrado por el hecho de que la prevención y el tratamiento de la trombosis venosa se proporciona mejor disminuyendo la actividad de la trombina, por inhibición directa (hirudina, melagastran) o por síntesis disminuida (antagonistas de vitamina K) o por descomposición incrementada (heparinas). En el último decenio se empezó a ver cada vez más claro que la trombina es tan importante en la enfermedad arterial como lo es en la enfermedad venosa. Los ensayos clínicos han mostrado que los antagonistas (2) de la vitamina K así como la heparina (3) disminuyen la tasa de reaparición del infarto de miocardio. Un papel de la trombina en la hemorragia es sugerido por el prolongado tiempo de hemorragia que se observa cuando la generación de trombina está tan profundamente afectada como en la sobredosis severa de anticoagulantes (4) orales o heparina (5). Además, las hemofilias son enfermedades del sistema (6) de formación de trombina.

Todos los elementos de la sangre participan en la formación de trombina

La investigación moderna ha conducido al reconocimiento de que la trombina se forma por la cooperación de los elementos formados de la sangre y plasma. Los glóbulos rojos (RBCs) son los menos activos en este aspecto aunque en un pequeño porcentaje de ellos la membrana externa exhibe actividad (7) precoagulante. Mucho más importante es que los glóbulos blancos llevan la actividad del factor tisular. Esta actividad normalmente está encriptada pero en lesiones se pone de manifiesto por medio de interacciones con las plaquetas (8, 9). Los principales jugadores son indudablemente las plaquetas y el sistema de coagulación plasmática. En los libros de texto se encuentra aún que las plaquetas son responsables de la hemostasia primaria y de la trombosis arterial mientras que la coagulación del plasma sirve para la consolidación del tapón hemostático y es el mecanismo detrás de la trombosis venosa. Esta visión es debida al hecho de que el plasma y las plaquetas se estudiaron por separado. En realidad la cooperación entre las plaquetas y el plasma y las otras células de la sangre es esencial tanto en la hemostasia primaria y secundaria como en la trombosis arterial y venosa. La formación del tapón de plaquetas desempeña un papel en la generación de trombina porque los intersticios en un agregado de plaquetas forman un nicho sin agitar en el que se puede formar la trombina sin ser barrida por la sangre circulante. Es por eso por lo que medir la generación de trombina en sangre entera coagulada es tan cercano a la realidad fisiológica.

Aparte de formar una "esponja" en la que se puede formar trombina, las plaquetas contribuyen también activamente a la generación de trombina. Liberan factor V y proporcionan la superficie de fosfolípido procoagulante requerida para la conversión de protrombina así como para las diferentes etapas en el mecanismo de coagulación que conduce a la formación (10) de protrombinasa. La velocidad de generación de trombina y la cantidad formada depende de este modo de la actividad de las plaquetas así como de las proteínas plasmáticas implicadas. Es particularmente interesante el papel de la fibrina polimerizante. El factor de Von Willebrand (vWf) interacciona con la fibrina polimerizante y sufre un cambio conformacional que la hace reactiva al receptor de plaquetas GPIb y por medio de esta unión coopera para que las plaquetas se vuelvan procoagulantes (11, 12). Esto muestra que formar un coágulo de fibrina no es el acto final de la hemostasia y que la formación de trombina en forma de un tapón (o trombo o coágulo) es un suceso clave en el procedimiento. Ciertamente, como veremos a continuación, >95% de toda la trombina formada se forma después de que ha tenido lugar la coagulación y esta trombina es esencial en el procedimiento de hemostasia y trombosis (H&T). Quizás la mejor prueba de las estrechas uniones entre las plaquetas y el sistema de coagulación plasmática es el hecho de que todos los "inhibidores de agregación" y otros agentes antiplaqueta también inhiben la generación de trombina en plasma rico en plaquetas (o sangre entera). Esto ha sido mostrado para aspirina (13), abciximab (14), MK383 (15) y clopidogrel (16). Inversamente, el hecho de que el fármaco antiplaquetas por excelencia, aspirina, previene la trombosis (17) venosa ilustra adicionalmente la cercana conexión entre la función de las plaquetas y la coagulación de la sangre.

Así, en resumen, la cantidad de trombina formada en un coágulo es una característica esencial en el procedimiento de hemostasia y trombosis y todos los elementos de la sangre participan en su formación.

Generación de trombina (TG) como indicador de riesgo trombótico y de hemorragia

La TG incrementada invariablemente indica riesgo trombótico, tanto si es debido a la deficiencia de antitrombina o a un exceso de protrombina. Además, en trastornos en el sistema de la proteína C (deficiencia de proteínas S y C, factor V_Leiden) la generación de trombina es más alta de lo normal. Esto vale para la coagulación del plasma como tal, pero se vuelve especialmente obvio si el sistema de la proteína C es activado por trombomodulina (fig. 1). La tendencia trombótica inducida por los contraconceptivos orales puede ser atribuida a una resistencia adquirida a la proteína C activada que provoca un incremento del 10% de la generación de trombina que se vuelve más obvia cuando se añade TM o APC (18, 19).

Un caso particularmente interesante es el anticoagulante lúpico. Este tipo de anticuerpo induce un incremento del tiempo retraso de la formación de trombina, y por lo tanto un incremento del tiempo de coagulación, pero también una importante resistencia a la actividad del sistema (20) de la proteína C. Esto explica la "paradoja de LE", es decir, un efecto anticoagulante que está acompañado de una tendencia trombótica.

Se ha encontrado que cantidades en exceso de los factores II, VIII y VII se correlacionan con la aparición de infarto de miocardio (21-24). Además, niveles más altos de lo normal de vWf que incrementan la generación de trombina (12) son un factor de riesgo para la trombosis arterial (25, 26).

En una subpoblación de jóvenes pacientes con apoplejía (alrededor de 30%) se ha mostrado que tanto la generación de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP) como el vWF son significativamente más altos de lo normal (27). En todas las deficiencias congénitas del factor de coagulación disminuye la generación de trombina. Esto ha sido demostrado para las hemofilias...

1. Un método para determinar in vitro la actividad de la trombina en una muestra biológica que es una muestra de sangre entera o una muestra de plasma y en el que la generación de trombina se mide por las etapas de:

- poner en contacto una capa de dicha muestra con un substrato fluorógeno de trombina y con una concentración conocida de fluoróforo en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina, y en el que dicha capa tiene un grosor dentro de un intervalo de 0,05 a 5 mm y una superficie dentro de un intervalo de 10 a 500 mm², y en el que dicha muestra se introduce en un recipiente que contiene medios que ayudan a la dispersión de la muestra;

- permitir que se genere trombina en dicha muestra;

- medir la fluorescencia emitida desde la superficie de la capa, por el grupo fluorescente desprendido del substrato fluorógeno como resultado de la acción enzimática de la trombina generada sobre dicho substrato fluorógeno.

2. Un método de la reivindicación 1, en el que la concentración de trombina generada durante el ensayo se determina como una función de la fluorescencia medida del grupo fluorescente desprendido.

3. Un método de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra de sangre entera se diluye dentro de un intervalo de un máximo de 10 veces.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el grosor de la capa de la muestra es de alrededor de 2 mm o menos.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que, para el ensayo, la muestra de sangre se introduce dentro de un pocillo de una placa que también contiene una malla con tamaño de malla de 50 a 500 μm.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que, para la muestra, la muestra de sangre se introduce en un pocillo de una placa que también contiene microbolas.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el pocillo que contiene la muestra de sangre está cubierto para la determinación de la actividad de la trombina.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cantidad de substrato de trombina añadida a la muestra está dentro de un intervalo de 50 a 1000 μM.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el substrato fluorógeno es un substrato sintético para trombina, unido a una molécula fluorescente.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que el substrato de trombina es un compuesto químico orgánico, unido a una molécula fluorescente.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el substrato fluorógeno es un oligopéptido que tiene una secuencia de 2 a 30 residuos aminoácido unidos a una molécula fluorescente.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que el oligopéptido tiene una lisina o arginina terminal para unirse a una molécula fluorescente.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la molécula fluorescente es AMC (7-amino4-metilcumarina).

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el pocillo comprende adicionalmente un gel, que contiene posiblemente iones calcio, en el que dicho gel no permite la dilución de la sangre de la muestra.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el factor tisular y los iones calcio se añaden a la muestra de sangre en cantidades que permiten que ocurra la generación de trombina.

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la muestra de sangre, es una muestra de sangre entera.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la muestra de sangre es una muestra de plasma, especialmente plasma rico en plaquetas (PRP).

18. El método según la reivindicación 16, en el que la muestra de sangre entera está citrada.

19. El uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para detectar o monitorizar una enfermedad hemostática o una enfermedad trombótica.

20. El uso según la reivindicación 19, para detectar o monitorizar la interacción de determinada(s) substancia(s) sobre la actividad de la trombina en una muestra de sangre entera, en el que dicha(s) substancia(s) determinada(s) se añade(n) a la muestra que se va a analizar o se añade(n) durante la generación de trombina.

21. El uso según la reivindicación 19 para monitorizar la interacción de factores de coagulación o fármacos.

22. El uso según la reivindicación 19 para examinar substancias para determinar su capacidad de interacción con la generación de trombina.

23. El uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la medida del potencial de trombina endógena (ETP) de la muestra de sangre entera.

24. El uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para la medida del tiempo hasta el máximo de trombina.

25. El uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para la medida del tiempo de coagulación.

26. El uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para la medida del nivel del máximo de trombina generada.

27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende una etapa de calibración.

28. Un kit para llevar a cabo un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende:

- un substrato fluorógeno para trombina,

- una concentración conocida de fluoróforo como estándar interno, en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina,

- factor tisular e iones calcio para permitir la generación de trombina,

- medios que ayudan a la dispersión de la muestra tales como una malla o microbolas que previenen la retracción del coágulo de sangre y ayuda a la dispersión de la sangre entera,

- opcionalmente un gel, que comprende posiblemente iones calcio.