Un procedimiento in vitro para detectar en una muestra de tejido a partir de una incisión en la piel de la oreja de un bovino,

ya sea el bovino positivo o negativo para el virus de la diarrea viral bovina, que comprende: a) frotar repetidamente un hisopo de algodón por la incisión en la piel de la oreja para obtener una muestra de tejido; b) suspender la muestra de tejido en un disolvente en condiciones efectivas para solubilizar cualquier proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo sin lisar las células; c) proporcionar un sistema de ensayo que comprende: 1) un anticuerpo de captura monoclonal que es un anticuerpo específico para un epítopo del virus de la diarrea viral bovina, estando inmovilizado dicho anticuerpo de captura sobre un soporte sólido y que puede reconocer y unirse a una proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo que conserva especificidad antigénica; y 2) un anticuerpo detector que es anticuerpo anti-virus de la diarrea viral bovina, que puede reconocer y unirse a dicha proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo que conserva especificidad antigénica; y 3) un generador de señal para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente al antígeno del virus de la diarrea viral bovina; d) analizar dicho disolvente en el que la muestra de tejido de la piel de la incisión en la oreja se suspende con dicho sistema de ensayo para generar un cambio en la señal si el antígeno del virus de la diarrea viral bovina está presente en la muestra; y e) comparar la señal con uno o más niveles de referencia para indicar si el bovino es positivo o negativo para virus de la diarrea viral bovina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la detección de la infección del virus de la diarrea viral bovina en muestras de tejidos de animales.

Antecedentes de la invención

El virus de la diarrea viral bovina (“VDVB”) representa actualmente una gran amenaza para la industria ganadera. Descrito por primera vez hace más de cincuenta años, se ha descubierto que este patógeno es tanto altamente virulento como de fácil propagación. Considerado un patógeno principal de los sistemas entérico, respiratorio, reproductor e inmunitario bovinos, el VDVB continúa produciendo mundialmente significativas pérdidas económicas a la industria ganadera. Se han producido brotes recientes en Canadá, Estados Unidos y en todo el mundo.

Clasificado como un miembro del género Pestivirus y de la familia Flaviviridae, el VDVB está estrechamente relacionado con el virus de la enfermedad de la frontera ovina (“VEF”) y el virus del cólera porcino (“VCP”), estando ambos pestivirus serológicamente relacionados. La secuenciación genómica total o parcial de aislados de pestivirus ha permitido la determinación de que entre los pestivirus está presente un alto grado de conservación de secuencias. Más recientemente se han identificado variantes antigénicas del VDVB y las cepas del VDVB se han dividido en dos genotipos bien diferenciados basados en la citopatogenicidad, tipo 1 y tipo 2, que se han subdividido adicionalmente. La tecnología de clonación molecular y de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha determinado que la estructura general del VDVB consiste en una proteína de la cápside y tres glicoproteínas de la envoltura. El genoma del VDVB es un ARN de 12,3 kb constituido por un único marco de lectura abierta (“ORF”). El virus VEF es en sí un virus de ARN envuelto, pequeño, con polaridad de cadena positiva. Este aspecto de hebra positiva del genoma viral permite que el ARN sea infeccioso, incluso en ausencia de proteínas del virión.

El VDVB se propaga a través de un rebaño de un modo fecal-oral, atacando los sistemas entérico, respiratorio, reproductor e inmunitario. La carga viral necesaria para provocar infección sintomática guarda relación con el tipo y la cepa de virus VEF. Además, el VDVB tiene la capacidad de infectar fetos al atravesar la placenta, dando frecuentemente como resultado un aborto espontáneo del feto y una disminución de la fertilidad resultante entre los animales infectados. Las estrategias para controlar el VDVB varían desde prácticas de gestión más estrictas en un esfuerzo por reducir simplemente la pérdida económica, hasta elaborar procedimientos de prueba para identificar animales infectados que, aunque sean eficaces, conllevan un nivel de coste inaceptable. El fracaso de las vacunaciones en condiciones de campo para el VDVB ha aumentado la necesidad de un protocolo de prueba que ayudará a identificar y eliminar animales infectados de una manera rentable.

También debe tenerse en cuenta que el VDVB, al igual que otros agentes de enfermedades infecciosas, está asociado con una amplia variedad de manifestaciones clínicas, creando un desafío diagnóstico muy difícil. Las manifestaciones comunes de la infección del VDVB pueden incluir: tormentas de abortos, infertilidad, ciclos térmicos irregulares, muertes embrionarias precoces, momificación fetal, inmunodepresión, disentería, trombocitopenia e hipoplasia cerebral. Además, los estudios serológicos han mostrado que un alto porcentaje de ganado infectado con VDVB, que incluye el considerado a estar persistentemente infectado (PI), permanece clínicamente asintomático. Tales condiciones hacen imprescindible que se desarrolle una prueba fidedigna, económica y fácil de usar para ayudar en la detección de animales infectados con VDVB en rebaños de ganado.

El virus VEF se mantiene normalmente en un rebaño debido a la presencia de animales portadores PI inmunotolerantes. Este ganado PI está expuesto al virus in utero, pero puede permanecer clínicamente asintomático durante el curso de sus vidas, expulsando continuamente materias fecales y fluidos corporales con una alta concentración de virus, y representando así una amenaza de infección para otros animales mientras que permanezcan en el rebaño. El virus puede estar presente en un rebaño en más de la mitad del ganado antes de que se presenten los signos propios de un brote. Los síntomas de la enfermedad van precedidos normalmente de leucopenia y los esfuerzos de prueba hasta la fecha se han centrado en identificar este efecto.

Los brotes anteriores de VDVB han dado como resultado catastróficas pérdidas económicas a la industria pecuaria. Por ejemplo, en Ontario en 1993, los casos de VDVB aumentaron el 23% en menos de un año. También debe tenerse en cuenta que, aunque la asignación histórica del VDVB como un pestivirus era a través de las especies a las se descubrió por primera vez que estaba asociado (por ejemplo ganado), ahora se sabe que los pestivirus pueden atravesar barreras de especies. Esto indica que en zonas en las que los rumiantes salvajes de granja (por ejemplo, alce americano, búfalo, etc.) están expuestos a rebaños de ganado infectados, estos animales también son susceptibles de infectarse con VDVB, o alternativamente pueden actuar como una reserva de virus que puede infectar un rebaño previamente “limpio”.

Se han comercializado más de ciento cincuenta vacunas para VDVB para ganaderos durante los últimos treinta años. Estas vacunas están constituidas por virus VEF vivos modificados o virus atenuados inactivados y partículas de virus. Se han producido brotes recientes del VDVB a pesar de la disponibilidad y uso de estas vacunas. Los enfoques actuales para la vacunación implican la inoculación anual repetida con vacuna para el ganado y generalmente se realizan etapas adicionales en un intento por asegurar que no nacen terneros como portadores PI. Sin embargo, para que sea posible el control eficaz del virus VEF, es esencial identificar los animales PI y sacarlos del rebaño. Se han desarrollado varios procedimientos de prueba diferentes para la detección del VDVB y/o la detección de animales infectados con VDVB. Estos procedimientos de prueba incluyen: transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa, inmunoensayo ligado a enzima (ELISA), técnicas habituales de aislamiento de virus e inmunohistoquímica (Haines y col., “Monoclonal Antibody-Based Immunohistochemical Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues,” Vet. Pathol., 29:27-32 (1992)).

Las dos técnicas de PCR y aislamiento de virus, debido a su sensibilidad inherente, pueden detectar niveles muy bajos del VDVB. Sin embargo, estos procedimientos también llevan mucho tiempo, son relativamente complejos y caros. La inmunohistoquímica en muestras de tejido, tales como muestras de biopsia de incisión en la oreja, es una técnica eficaz para detectar animales PI. Sin embargo, esta técnica lleva mucho tiempo, requiere un trabajo intenso y técnicos altamente cualificados. La tecnología ELISA, aunque algo menos sensible, es más conveniente como una herramienta diagnóstica general para detectar infección del VDVB en animales debido a que es rentable, da resultados en un corto periodo de tiempo y no requiere técnicos altamente cualificados y un laboratorio altamente especializado. Sin embargo, las pruebas de ELISA de captura de antígeno para VDVB se han basado históricamente en el uso de extractos de glóbulos blancos del animal que va a someterse a ensayo. Los extractos de glóbulos blancos han sido necesarios debido a que las proteínas del VDVB se acumulan en concentraciones relativamente altas dentro de los glóbulos blancos de animales infectados y los procedimientos de ELISA anteriores carecían de la sensibilidad para detectar sus proteínas del VDVB diana en suero sanguíneo (Horner y col., “Comparison of an Antigen Capture Enzyme-Linked Assay with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction and Cell Culture Immunoperoxidase Tests for the Diagnosis of Ruminant Pestivirus Infections,” Vet. Microbiol., 43:75-84 (1995)). La propia preparación de extractos de glóbulos blancos lleva mucho tiempo y es relativamente cara, haciendo que cualquier prueba de ELISA dependa costosamente por sí sola de esta extracción.

Debido a que los procedimientos anteriormente mencionados para detectar infección del VDVB en animales no sólo llevan mucho tiempo, sino que frecuentemente requieren laboratorios sofisticados y técnicos altamente cualificados para completarlos, son económicamente prohibitivos para usarlos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para detectar en una muestra de tejido a partir de una incisión en la piel de la oreja de un bovino, ya sea el bovino positivo o negativo para el virus de la diarrea viral bovina, que comprende:

a) frotar repetidamente un hisopo de algodón por la incisión en la piel de la oreja para obtener una muestra de tejido;

b) suspender la muestra de tejido en un disolvente en condiciones efectivas para solubilizar cualquier proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo sin lisar las células;

c) proporcionar un sistema de ensayo que comprende:

1) un anticuerpo de captura monoclonal que es un anticuerpo específico para un epítopo del virus de la diarrea viral bovina, estando inmovilizado dicho anticuerpo de captura sobre un soporte sólido y que puede reconocer y unirse a una proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo que conserva especificidad antigénica; y

2) un anticuerpo detector que es anticuerpo anti-virus de la diarrea viral bovina, que puede reconocer y unirse a dicha proteína gp48 del virus de la diarrea viral bovina o fragmento de proteína del mismo que conserva especificidad antigénica; y

3) un generador de señal para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente al antígeno del virus de la diarrea viral bovina;

d) analizar dicho disolvente en el que la muestra de tejido de la piel de la incisión en la oreja se suspende con dicho sistema de ensayo para generar un cambio en la señal si el antígeno del virus de la diarrea viral bovina está presente en la muestra; y

e) comparar la señal con uno o más niveles de referencia para indicar si el bovino es positivo o negativo para virus de la diarrea viral bovina.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo específico para un epítopo del virus de la diarrea viral bovina es el anticuerpo monoclonal designado como 15.c.5.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo detector es un anticuerpo policlonal.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo detector es un anticuerpo monoclonal.