Detección ultrasensible de moléculas o partículas usando perlas u otros objetos de captura.

Un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido,

que comprende

exponer una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula, a una disolución que contiene o que se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas de analito o partículas;

inmovilizar las moléculas de analito o partículas con respecto a la pluralidad de objetos de captura de manera que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con al menos una molécula de analito o partícula y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito o partícula;

segregar espacialmente al menos una porción de los objetos de captura sometidos a la etapa de inmovilización en una pluralidad de localizaciones separadas que comprenden una pluralidad de recipientes de reacción de manera que estadísticamente solo ningún o un objeto de captura está situado en el recipiente de reacción;

sellar herméticamente los recipientes de reacción tras la adición de los objetos de captura y del agente de marcaje precursor opcional;

asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones sometidas a la etapa de segregación espacial y determinar el número de dichas localizaciones que contienen al menos una molécula de analito o partícula, en el caso de detección directa interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en la molécula de analito o partícula o, en el caso de detección indirecta, interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor mediante exposición a la molécula o partícula; y

determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de localizaciones que se determina que contienen una molécula de analito o partícula.

Detección ultrasensible de moléculas o partículas usando perlas u otros objetos de captura Campo de la invención Se describen métodos para detectar moléculas de analitos o partículas en una muestra de fluido y, en algunos casos, determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas en la muestra de fluido.

Antecedentes de la invención Los métodos y sistemas que son capaces de detectar rápida y exactamente y, en ciertos casos, cuantificar una molécula de analito diana en una muestra son las piedras angulares de las medidas analíticas modernas. Tales sistemas y/o métodos se emplean en muchas áreas, tales como investigación académica e industrial, evaluación medioambiental, seguridad alimentaria, diagnóstico médico, y detección de agentes de guerra química, biológica, y/o radiológica. Las características ventajosas de tales técnicas pueden incluir especificidad, velocidad, y sensibilidad.

La mayoría de las técnicas actuales para cuantificar niveles bajos de moléculas de analito en una muestra usan procedimientos de amplificación para incrementar el número de moléculas informadoras a fin de ser capaces de proporcionar una señal medible. Por ejemplo, estos procedimientos conocidos incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA) para amplificar la señal en ensayos a base de anticuerpos, así como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar hebras de ADN diana en ensayos a base de ADN. Una técnica de amplificación de la diana proteica más sensible pero indirecta, denominada immunoPCR (véanse Sano, T.; Smith, C. L.; Cantor, C. R. Science 1992, 258, 120-122) , hace uso de marcadores oligonucleotídicos, que se pueden amplificar subsiguientemente usando PCR y se pueden detectar usando un ensayo de hibridación de ADN (véanse Nam, J. M.; Thaxton, C. S.; Mirkin, C. A. Science 2003; 301, 1884-1886; Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Pignataro, B.; Lenhert, S.; Gao, S.; Chi, L. F.; Fuchs, H.; Blohm, D. Nucleic Acids Research 1999, 27, 4553-4561; y Zhou, H.; Fisher, R. J.; Papas, T. S. Nucleic Acids Research 1993, 21, 6038-6039) . Mientras que el método de immuno-PCR permite la detección de proteínas a nivel ultra bajo, es un procedimiento de ensayo complejo, y puede ser propenso a la generación de señales positivas falsas (véase Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Wacker, R. Trends in Biotechnology 2005, 23, 208-216) .

El documento WO 2009/029073 A1 fue señalado por la Oficina de Patente Europea como la técnica anterior más cercana durante la consecución de esta patente, y describe un método para medir la concentración de un analito o analitos en una disolución. El método descrito allí se puede llevar a cabo usando un número de diferentes formatos de ensayo, incluyendo en recipientes de reacción definidos, al menos en parte, por los extremos distales de hebras de fibras ópticas.

Una característica de los métodos y/o sistemas conocidos típicos para detectar o cuantificar concentraciones bajas de un analito particular en disolución es que se basan en respuestas de conjunto en las que muchas moléculas de analito dan lugar a una señal medida. La mayoría de los esquemas de detección requiere que esté presente un gran número de moléculas en el conjunto para que la señal total esté por encima del umbral de detección. Este requisito limita la sensibilidad de la mayoría de las técnicas de detección y el intervalo dinámico (es decir, el intervalo de concentraciones que se puede detectar) . Muchos de los métodos y técnicas conocidos están plagados además de problemas de unión no específica, que es la unión de moléculas de analito o partículas a detectar o especies informadoras no específicamente a sitios distintos de los esperados. Esto conduce a un incremento en la señal de fondo, y por lo tanto limita la concentración más baja que se puede detectar exacta o reproduciblemente.

En consecuencia, se necesitan métodos mejorados para detectar y, opcionalmente, cuantificar moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido, especialmente en muestras en las que tales moléculas o partículas están presentes a concentración muy baja.

Sumario de la invención Se describen aquí sistemas y métodos para detectar moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido y, en algunos casos, determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas en la muestra de fluido.

Se describen aquí diversos sistemas, métodos, artículos y kits para proporcionar un marco adecuado para entender la presente invención. No obstante, se entiende que la invención para la que se busca protección es aquella como se define por las reivindicaciones.

En una realización de la invención, un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido que comprende exponer una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula, a una disolución que contiene o que se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas de analito o partículas, inmovilizar las moléculas de analito o partículas con respecto a la pluralidad de objetos de captura de manera que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con una única molécula de analito o partícula y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito o

partícula, segregar espacialmente al menos una porción de los objetos de captura sometidos a la etapa de inmovilización en una pluralidad de localizaciones separadas, asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones sometidas a la etapa de segregación espacial y determinar el número de dichas localizaciones que contienen una molécula de analito o partícula, y determinar una medida de la concentración de moléculas de analito

o partículas en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de localizaciones que se determina que contienen una molécula de analito o partícula.

En una realización adicional de la invención, un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido comprende exponer una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula, a una disolución que contiene o que se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas de analito

o partículas para formar objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito o partícula inmovilizada, mezclar los objetos de captura preparados en la etapa de exposición con una pluralidad de ligandos de unión de manera que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con un único ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ningún ligando de unión, segregar espacialmente al menos una porción de los objetos de captura sometidos a la etapa de mezclamiento en una pluralidad de localizaciones, asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones sometidas a la etapa de segregación espacial y determinar el número de localizaciones que contienen un ligando de unión, y determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de localizaciones que se determina que contienen un ligando de unión. cada localización asignada la presencia o ausencia de una perla y, si está presente, si la perla comprende cualesquiera moléculas de analito o partículas, y determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido al menos en parte determinando el número de localizaciones asignadas que contienen una perla que comprende al menos una molécula de analito o partícula.

En algunas realizaciones, un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido comprende proporcionar un sustrato que comprende una pluralidad de localizaciones, al menos una porción de las cuales contiene una perla, en el que con respecto al número total de perlas presentes en el sustrato, la relación de perlas que comprenden al menos una molécula de analito o partícula asociadas con un ligando de unión a perlas que no comprenden moléculas de analito o partículas asociadas con un ligando de unión está entre alrededor de 8:1 y alrededor de 1:10.000.000, asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones, en el que durante la etapa de asignación al menos dos de la pluralidad de localizaciones se asignan al menos parcialmente... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido, que comprende exponer una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula, a una disolución que contiene o que se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas de analito o partículas;

inmovilizar las moléculas de analito o partículas con respecto a la pluralidad de objetos de captura de manera que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con al menos una molécula de analito o partícula y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito o partícula;

segregar espacialmente al menos una porción de los objetos de captura sometidos a la etapa de inmovilización en una pluralidad de localizaciones separadas que comprenden una pluralidad de recipientes de reacción de manera que estadísticamente solo ningún o un objeto de captura está situado en el recipiente de reacción;

sellar herméticamente los recipientes de reacción tras la adición de los objetos de captura y del agente de marcaje precursor opcional;

asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones sometidas a la etapa de segregación espacial y determinar el número de dichas localizaciones que contienen al menos una molécula de analito o partícula, en el caso de detección directa interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en la molécula de analito o partícula o, en el caso de detección indirecta, interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor mediante exposición a la molécula o partícula; y determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de localizaciones que se determina que contienen una molécula de analito o partícula.

2. Un método para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en una muestra de fluido, que comprende exponer una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula, a una disolución que contiene o que se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas de analito o partículas para formar objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito o partícula inmovilizada;

mezclar los objetos de captura preparados en la etapa de exposición con una pluralidad de ligandos de unión de manera que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con un único ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ningún ligando de unión;

segregar espacialmente al menos una porción de los objetos de captura sometidos a la etapa de mezclamiento en una pluralidad de localizaciones que comprenden una pluralidad de recipientes de reacción de manera que estadísticamente solo ningún o un objeto de captura está situado en un recipiente de reacción;

sellar herméticamente los recipientes de reacción tras la adición de los objetos de captura y del agente de marcaje precursor opcional;

asignar al menos una porción de la pluralidad de localizaciones sometidas a la etapa de segregación espacial y determinar el número de localizaciones que contienen un ligando de unión, en el caso de detección directa interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en el ligando de unión o, en el caso de detección indirecta, interrogando y/o detectando una molécula o resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor mediante exposición al ligando de unión; y determinar una medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de localizaciones que se determina que contienen un ligando de unión.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el porcentaje de objetos de captura que se asocian con al menos una molécula de analito o ligando de unión es menor que alrededor de 50% del número total de objetos de captura, o en el que el porcentaje de objetos de captura que no se asocian con ninguna molécula de analito o ligando de unión es al menos alrededor de 20% del número total de objetos de captura.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que, en la etapa de asignación, se determina el número de dichas localizaciones que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula que no contiene una molécula de analito o partícula.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la medida de la concentración de la molécula de analito o partículas en la muestra de fluido se basa al menos en parte en la relación del número de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que se determina que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula que contiene al menos una molécula de analito o partícula, al número total de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que se determina que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito

o partícula.

6. El método de la reivindicación 4, en el que la medida de la concentración de molécula de analito o partículas en la muestra de fluido se basa al menos en parte en la relación del número de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que se determina que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula que contiene al menos una molécula de analito o partícula o un ligando de unión, al número de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que se determina que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula pero que no contiene ningún objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula que contiene al menos una molécula de analito o partícula o un ligando de unión.

7. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la medida de la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido se basa al menos en parte en la relación del número de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que se determina que contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula que contiene al menos una molécula de analito o partícula o ligando de unión, al número de localizaciones asignadas en la etapa de asignación que no contienen un objeto de captura que incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito

o partícula.

8. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la pluralidad de objetos de captura que incluyen una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula comprende una pluralidad de perlas.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el diámetro medio de la pluralidad de perlas está entre alrededor de 0, 1 micrómetros y alrededor de 100 micrómetros, preferiblemente en el que el diámetro medio de la pluralidad de perlas está entre alrededor de 1 micrómetro y alrededor de 10 micrómetros.

10. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el volumen medio de la pluralidad de recipientes de reacción está entre alrededor de 10 attolitros y alrededor de 100 picolitros, más preferiblemente en el que el volumen medio de la pluralidad de recipientes de reacción está entre alrededor de 1 femtolitro y alrededor de 1 picolitro.

11. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que las moléculas de analito o partículas o ligando de unión comprende un componente enzimático.

12. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la concentración de moléculas de analito o partículas en la muestra de fluido es menor que alrededor de 50 x 10-15 M.

13. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que, durante la etapa de segregación espacial, al menos alrededor de 0, 5% de los objetos de captura sometidos a las etapas de inmovilización están separados espacialmente en la pluralidad de localizaciones.

14. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la porción de los objetos de captura que incluyen una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito o partícula se separan espacialmente exponiendo la pluralidad de localizaciones a una disolución que comprenden la pluralidad de objetos de captura.

15. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que las moléculas de analito o partículas son proteínas o ácidos nucleicos.