Detección de Staphylococcus aureus e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

Un procedimiento de detección específica de la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus (S.

aureus) y detección e identificación específica de una cepa de S. aureus resistente a meticilina de una muestraclínica en un único ensayo, que comprende

poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda de nuc de al menos 13 nucleótidos que sehibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para S. aureus dentro de SEQ ID NO: 200 o elcomplemento de la misma;

poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda MREJ de al menos 13 nucleótidos que sehibrida bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos dentro de al menos una de lassiguientes SEQ ID NOs específicas para MREJ: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88, o el complementode las mismas, en el que el al menos un cebador y/o sonda se hibridan conjuntamente bajo condiciones rigurosascon secuencias de orfX específicas para especies de S. aureus y secuencias polimórficas de la extremidad derechade SCCmec; y

detectar la presencia y/o cantidad de sonda(s) nuc y MREJ hibridadas como indicativa de la presencia y/o cantidadde S. aureus y MRSA en la muestra, respectivamente, o detectar la cantidad de un producto de amplificaciónproducido mediante hibridación de los cebadores nuc y MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de lapresencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA, respectivamente,

en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 5mM, 0,15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

Detección de Staphylococcus aureus e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud está siendo presentada junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado GENOM.072A.TXT, creado el 29 de noviembre de 2007, que tiene 124 KB de tamaño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los miembros del género Staphylococcus son patógenos humanos importantes, causando una amplia variedad de infecciones intrahospitalarias y extrahospitalarias en el mundo. La especie positiva para coagulasa 15 Staphylococcus aureus está bien documentada como patógeno oportunista humano (Murray y col. Eds, 2003, Manual of Clinical Microbiology, 8ª ed., ASM Press, Washington, D.C.) . Las infecciones nosocomiales producidas por

S. aureus son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Algunas de las infecciones más comunes producidas por S. aureus implican la piel, e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, impétigo e infecciones por heridas posoperatorias en diversos sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son bacteremia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, dermatitis exfoliativa y diversos abscesos. El envenenamiento de los alimentos mediado por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante asociado a S. aureus. El síndrome del choque tóxico, una enfermedad extrahospitalaria, también se ha atribuido a infección o colonización con S. aureus toxigénico.

Los estafilococos negativos para coagulasa se habían considerado comensales de la piel inofensivos antes de los años 70; sin embargo, ahora se reconocen como una causa importante de infecciones humanas (Kloos y col. (2004) Clin. Microbiol. Rev. 7:117-140) . Además de estar entre las bacterias más frecuentemente aisladas en laboratorios de microbiología clínica, los estafilococos negativos para coagulasa sirven de depósitos de determinantes de resistencia antimicrobiana (Bastos y col. (1999) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18:393-398) .

Como tal, es importante caracterizar y distinguir cepas de S. aureus de otros estafilococos negativos para coagulasa.

Las cepas de S. aureus producen una nucleasa termoestable extracelular (TNasa termoestable) con una frecuencia similar a la que producen coagulasa. La secuencia del gen que codifica TNasa, nuc, se desveló por primera vez en 1985 (Kovacevi y col. (1985) , J. Bact. 162:521-528) . La TNasa es una proteína de 17 kDa que 35 degrada tanto ARN como ADN a temperaturas de hasta 100 ºC. La actividad de TNasa no es específica para S. aureus, sin embargo, existen secuencias específicas para especies de S. aureus. Véanse, por ejemplo, Brackstad y col. (1992) , J. Clin. Microbiol. 30:1654-1660; Zhang y col. (2004) , J. Clin. Microbiol. 42:4947-4955; Chesneau y col. (1993) Mol. Cell Probes 7:301-310, Wilson y col. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:1793-1798; Poulsen y col., (2003) J. Antimicrob. Chemo. 51:419-421, Costa y col., (2005) , Diag. Microbiol. and Infect. Dis, 51: 13-17, Shittu y

col., (2006) , Diagn Microbiol Infect Dis. 17 de julio de 2006. Hasta la fecha, ninguna de las secuencias de nuc específicas para S. aureus ha demostrado ser clínicamente útil a modo de un gran estudio de especificidad. Por tanto, existe una necesidad de oligonucleótidos que hayan demostrado ser tanto altamente específicos como sensibles, que sean útiles en la rápida detección e identificación de S. aureus de muestras clínicas.

Tanto S. aureus como los estafilococos negativos para coagulasa tienen una capacidad sorprendente para acumular determinantes resistentes a antibióticos adicionales, produciendo la formación de cepas resistentes a múltiples fármacos. Esta resistencia limita las opciones terapéuticas para el tratamiento y sustancialmente aumenta la morbilidad y mortalidad del paciente. S. aureus resistente a meticilina (MRSA) emergió en los años 80 como un problema clínico y epidemiológico importante en los hospitales (Oliveira y col., (2002) Lancet Infect Dis. 2:180-189) .

MRSA son resistentes a todas las º-lactamas que incluyen penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos, que son los antibióticos más comúnmente usados para curar infecciones por S. aureus. Las infecciones por MRSA solo pueden tratarse con antibióticos más tóxicos y más costosos que se usan normalmente como última línea de defensa. Como MRSA puede propagarse fácilmente de paciente a paciente mediante el personal, los hospitales en el mundo se enfrentan al problema de controlar MRSA.

La resistencia a meticilina en S. aureus es única porque es debida a la adquisición de ADN de otros estafilococos negativos para coagulasa (CNS) , que codifican una proteína de unión a penicilina (PBP) resistente a ºlactama supernumeraria que asume las funciones biosintéticas de las PBP normales cuando la célula se expone a antibióticos de º-lactama. S. aureus normalmente contiene cuatro PBP, de las que PBP 1, 2 y 3 son esenciales. La PBP de baja afinidad en MRSA, llamada PBP 2a (o PBP2') , está codificada por el gen mecA cromosómico y sirve de transpeptidasa resistente a -lactama. El gen mecA está ausente de S. aureus sensible a penicilina, pero está ampliamente distribuido entre otras especies de estafilococos y está altamente conservado (Ubukata y col., (1990) Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172) .

La determinación de la secuencia de nucleótidos de la región de ADN que rodea el gen mecA de la cepa N315 de S. aureus (aislada en Japón en 1982) condujo al descubrimiento de que el gen mecA es llevado por un novedosos elemento genético, designado cromosoma en casete estafilocócico mec (SCCmec) , que se inserta en el cromosoma. SCCmec es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de repeticiones invertidas y

directas terminales, un conjunto de genes recombinasa específicos para sitio (ccrA y ccrB) y el complejo del gen mecA (Ito y col., (1999) Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama y col., (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555) . SCCmec se escinde precisamente del cromosoma de la cepa N315 de S. aureus y se integra en un sitio cromosómico de S. aureus específico en la misma orientación mediante recombinasas codificadas por los genes ccrA y ccrB. La clonación y el análisis de secuencias del ADN que rodean el gen mecA de las cepas de MRSA NCTC 10442 (la primera cepa de MRSA aislada en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985) condujo al descubrimiento de dos elementos genéticos novedosos que compartieron características estructurales similares de SCCmec. Los tres SCCmec se han designado tipo I (NCTC 10442) , tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año de aislamiento de las cepas (Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336) . Hiramatsu y col. han encontrado que los ADN de SCCmec están integrados en un sitio específico en el cromosoma de S. aureus sensible a meticilina (MSSA) . Se analizaron la secuencia de nucleótidos de las regiones que rodean los límites derecho e izquierdo de ADN de SCCmec (es decir, attL y attR, respectivamente) , además de aquellas de las regiones alrededor del sitio de integración de ADN de SCCmec (es decir, attBscc que es el sitio de unión a cromosoma bacteriano para ADN de SCCmec) . El análisis de secuencias de los sitios attL, attR y attBscc revelaron que attbscc se localiza en el extremo 3' de un marco de lectura abierto (ORF)

novedoso, orfX. orfX codifica un polipéptido putativo de 159 aminoácidos que presenta homología de secuencias con algunos polipéptidos previamente identificados de función desconocida (Ito y col., (1999) Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458) . Dos nuevos tipos de SCCmec, designados tipo IV y tipo V, se describieron recientemente (Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152, Ito y col., (2004) Antimicrob Agents Chemother. 48:2637-2651, Oliveira y col., (2001) Microb. Drug Resist. 7:349-360) . Oliveira y col. también informaron recientemente de la existencia de tipo VI de SCCmec. Oliveira y col., (2006) , Antimicrob Agents Chemother. 50:3457-3459. Se ha determinado la secuencia de la extremidad derecha de algunas cepas de Staphylococcus clasificadas como tipo IV de SCCmec. Véanse Ma y col., (2002) Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152; Ito y col., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Oliveira y col., (2001) Microb. Drug Resist. 7:349-360. Secuencias de las cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P, clasificadas como tipo IV de SCCmec, fueron casi idénticas en 2000 nucleótidos con la de SCCmec de tipo II de la cepa N315 de S. aureus... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección específica de la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus) y detección e identificación específica de una cepa de S. aureus resistente a meticilina de una muestra clínica en un único ensayo, que comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda de nuc de al menos 13 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia específica para S. aureus dentro de SEQ ID NO: 200 o el complemento de la misma;

poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador y/o sonda MREJ de al menos 13 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos dentro de al menos una de las siguientes SEQ ID NOs específicas para MREJ: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88, o el complemento de las mismas, en el que el al menos un cebador y/o sonda se hibridan conjuntamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de orfX específicas para especies de S. aureus y secuencias polimórficas de la extremidad derecha de SCCmec; y

detectar la presencia y/o cantidad de sonda (s) nuc y MREJ hibridadas como indicativa de la presencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA en la muestra, respectivamente, o detectar la cantidad de un producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores nuc y MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus y MRSA, respectivamente,

en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8, 3) , KCl 10 mM, (NH4) 2SO4 5 mM, 0, 15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un cebador y o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO: 200 comprende un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con al menos 11 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas.

3. Un procedimiento de detección e identificación específica de S. aureus sensible a meticilina y S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en un único ensayo que comprende:

proporcionar al menos un cebador y/o sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas;

proporcionar al menos un cebador específico para una cepa de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) , siendo dicha cepa de MRSA resistente debido a la presencia de un inserto de SCCmec que contiene un gen mecA, estando dicho SCCmec insertado en ácidos nucleicos bacterianos generando así un empalme polimórfico de la extremidad derecha (MREJ) o cualquier nomenclatura equivalente, en el que dichos cebador (es) y/o sonda (s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos, comprendiendo dicho MREJ polimórfico tipos i a xx de MREJ;

hibridar los ácidos nucleicos de la muestra con el (los) cebador (es) y/o sonda (s) , en el que la hibridación de al menos un cebador y/o sonda bajo condiciones rigurosas con una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 12 o los complementos de las mismas indica la presencia de una cepa de S. aureus en la muestra, y en el que la hibridación de al menos un cebador y/o sonda bajo condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos, comprendiendo dicho MREJ polimórfico tipos i a xx de MREJ; indican la presencia de una cepa de MRSA en la muestra,

detectar la presencia y/o cantidad de sonda (s) nuc o MREJ hibridadas, o detectar la cantidad de un producto de amplificación producido mediante hibridación de los cebadores nuc o MREJ con los ácidos nucleicos, como indicación de la presencia y/o cantidad de S. aureus, y como indicación de la presencia y/o cantidad de MRSA, respectivamente,

en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8, 3) , KCl 10 mM, (NH4) 2SO4 5 mM, 0, 15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los cebadores y/o sondas se hibridan con dicho ácido nucleico de muestra bajo las mismas condiciones de hibridación; preferentemente en el que el cebador y/o sondas se disponen en conjunto en el mismo recinto físico.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador (es) y/o sonda (s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con secuencias polimórficas de la extremidad derecha de SCCmec de al menos uno de los tipos i a xx de MREJ, definidas en una cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador (es) y/o sonda (s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 132, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168 169, 170, 171, 172, 173, 114, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 201 (tipos i-ix) 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 197 (tipos xi-xx) o 199, o el complemento de las mismas.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos cebador (es) y/o sonda (s) específicos para MRSA se hibridan bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 99, 199, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas; que comprenden opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una cualquiera de SEQ ID NOs: 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos un par de cebadores, comprendiendo dicho par de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de

SEQ ID NOs: 1 y 5;

SEQ ID NOs: 1 y 6;

SEQ ID NOs: 2 y 6;

SEQ ID NOs: 4 y 7;

SEQ ID NOs: 4 y 8;

SEQ ID NOs: 3 y 7, y

SEQ ID NOs: 3 y 8, o los complementos de las mismas; opcionalmente, que comprende además poner en contacto dicha muestra con al menos un par de cebadores que comprende un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de:

SEQ ID NOs: 99 y 199;

SEQ ID NOs: 99 y 144;

SEQ ID NOs: 99 y 150;

SEQ ID NOs: 99 y 155; y

SEQ ID NOs: 99 y 163, o el complemento de las mismas.

9. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, comprendiendo dichos pares de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

SEQ ID NOs: 3 y 7;

SEQ ID NOs: 99 y 199;

SEQ ID NOs: 99 y 144;

SEQ ID NOs: 99 y 150;

SEQ ID NOs: 99 y 155; y

SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas; comprendiendo opcionalmente además poner en contacto la muestra con al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

10. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha muestra se pone en contacto con una pluralidad de pares de cebadores, comprendiendo dichos pares de cebadores un primer cebador y un segundo cebador que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ácidos nucleicos de:

SEQ ID NOs: 1 y 6;

SEQ ID NOs: 99 y 199;

SEQ ID NOs: 99 y 144;

SEQ ID NOs: 99 y 150;

SEQ ID NOs: 99 y 155; y

SEQ ID NOs: 99 y 163, o los complementos de las mismas; comprendiendo opcionalmente además poner en contacto la muestra con al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

11. Un kit para detectar la presencia de una cepa de Staphylococcus aureus y de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) en una muestra que comprende ácidos nucleicos en un único ensayo, que comprende al menos un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una de las siguientes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12, o el complemento de las mismas; y al menos un cebador específico para una cepa de MRSA que se hibrida bajo dichas condiciones rigurosas con ácidos nucleicos de MREJ polimórficos de SEQ ID NO: 14; en el que dichos oligonucleótidos tienen al menos 10 nucleótidos de longitud, y en el que dichas condiciones rigurosas comprenden MgCl2 4 mM, Tris 100 mM (pH 8, 3) , KCl 10 mM, (NH4) 2SO4 5 mM, 0, 15 mg/ml de BSA, 4% de trehalosa a 59 ºC.

12. El kit de la reivindicación 11, en el que dicho al menos un oligonucleótido específico para MRSA se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 199, o el complemento de las mismas.

13. El kit de la reivindicación 11, que comprende una pluralidad de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 1, 6, 99, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas, que comprende opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 9, 10, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas; o que comprende una pluralidad de oligonucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 3, 8, 99, 144, 150, 155 y 163, o el complemento de las mismas, que comprende opcionalmente además al menos una sonda que se hibrida bajo condiciones rigurosas con las siguientes SEQ ID NOs: 11, 12, 126, 128, 130 ó 131, o el complemento de las mismas.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el procedimiento comprende usar cebadores y/o sondas en una reacción de amplificación.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la reacción de amplificación comprende PCR

múltiplex.