Detección de isómeros utilizando espectrometría de masas con derivatización diferencial.

Un método para evaluar los isómeros moleculares de la leucina,

comprendiendoeste método:

la derivatización de uno o más isómeros moleculares de leucina en unamuestra que comprende un isómero molecular de leucina marcado con uno omás átomos pesados como un primer estándar;

la adición, a la muestra, tras la derivatización, de un isómero molecularderivatizado o no derivatizado de leucina que está marcado con uno o másátomos pesados como un segundo estándar;

la evaluación de la muestra utilizando espectrometría de masas tándem; yla detección de picos indicativos de formas derivatizadas y no derivatizadas deuno o más isómeros moleculares de leucina en la muestra.

ANTECEDENTES

La espectrometría de masas es una técnica usada para analizar la relación masa/carga de los iones. Puede usarse para proporcionar la composición de un analito concreto generando un espectro de masas que representa los componentes del analito (espectrometría de masas tándem) . Algunas de sus aplicaciones incluyen la filtración de muestras biológicas en busca de marcadores de desórdenes o enfermedades específicas. [0002] Chace et al, Clinical Chemistr y Vol. 41 nº 1, páginas 62-68 describe un método de diagnóstico de la Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce en manchas de sangre de recién nacidos mediante espectrometría de masas en el que los aminoácidos ramificados presentes en las muestras se derivatizan y en el que se añaden como estándares internos al menos dos aminoácidos de cadena ramificada no derivatizados marcados con un átomo pesado. [0003] Hasegawa et al, Drug Metabolism and Disposition Vol. 28 nº 8, páginas 920924 describe un análisis espectrométrico de masas de la leucina en una muestra de sangre que contiene DL-[2H3] Leu como estándar interno.

RESUMEN

De conformidad con la presente invención, se proporciona un método para evaluar isómeros moleculares de leucina de conformidad con la reivindicación independiente 1. [0005] La invención también proporciona un método de diagnóstico de la enfermedad de la orina de jarabe de arce que se describe en la reivindicación independiente 14. [0006] Otro aspecto de la invención lo constituye el uso de un primer estándar de isómero molecular primero no derivatizado de leucina marcado con uno o más átomos pesados y un segundo estándar de isómero molecular segundo derivatizado o no derivatizado de leucina marcado con uno o más átomos pesados en cualquiera de dichos métodos. [0007] La Espectrometría de Masas (conocida por sus siglas en inglés MS) puede utilizarse para evaluar aminoácidos de cadena ramificada y puede utilizarse para distinguir entre aminoácidos de cadena ramificada que son isómeros moleculares, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina. Los métodos para detectar aminoácidos de cadena ramificada isoméricos pueden incluir la derivatización de una muestra, por ej., esterificando la muestra. Sin embargo, dichos aminoácidos normalmente se derivatizan con diferentes eficacias. [0008] Las diversas eficacias de derivatización pueden utilizarse para mejorar la especificidad y/o la sensibilidad de detección de varios aminoácidos de cadena ramificada. Los estándares internos, por ej., los aminoácidos de cadena ramificada marcados con uno o más isótopos pesados pueden utilizarse para rastrear la eficacia de la derivatización y, de este modo, mejorar la detección y cuantificación de los aminoácidos de cadena ramificada de una muestra. En algunos casos, se utilizan al menos dos estándares internos. Los estándares son isoméricos con los aminoácidos de cadena ramificada pero tienen diferente peso molecular dado que tienen diferente marcado de isótopo pesado. En algunas realizaciones, se añade un estándar antes de la derivatización y el otro se añade después de la derivatización. En algunas realizaciones, un estándar se corresponde con un aminoácido derivatizado y el otro se corresponde con un aminoácido no derivatizado. [0009] Se describre un método para evaluar isómeros moleculares de aminoácidos de cadena ramificada, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina. El método incluye derivatizar uno o más isómeros moleculares de aminoácidos de cadena ramificada en una muestra que comprenda un aminoácido de cadena ramificada marcado con uno o más átomos pesados como primer estándar. El primer estándar puede ser, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina. Tras la derivatización, un aminoácido de cadena ramificada derivatizado o uno no derivatizado que esté marcado con uno o más átomos pesados se añade a la muestra como segundo estándar. El segundo estándar puede ser, por ejemplo, leucina, isoleucina y aloisoleucina. La muestra se evalúa espectrometría de masas tándem y en la muestra se detectan picos que indican formas no derivatizadas o derivatizadas, por ej., formas butiladas y no butiladas de uno o más aminoácidos de cadena ramificada, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina.

Las formas derivatizadas del primer y segundo estándar pueden tener diferentes pesos moleculares como resultado de un marcado con átomos pesados diferentes. Las formas no derivatizadas del primer y del segundo estándar pueden tener pesos moleculares diferentes como resultado de un marcado diferente con átomos pesados.

El método, además, puede incluir la determinación de la eficacia de derivatización de un aminoácido de cadena ramificada mediante referencia al los estándares primero y segundo. El método, además, puede incluir la determinación de la concentración de un aminoácido de cadena ramificada en la muestra utilizando la eficacia de derivatización. [0012] La derivatización puede ser la esterificación, por ej., llevada a cabo con un alcohol, por ej., butanol, isopropanol, etanol y metanol. El paso de la esterificación puede incluir la adaptación de uno o más parámetros, por ej., la temperatura y el tiempo de incubación, para reducir el nivel de esterificación de uno o ambas de entre isoleucina y la aloisoleucina. Menos del 100% de los aminoácidos de cadena ramificada pueden ser derivatizados, por ej., esterificados, por ej., aproximadamente el

80-94% de la leucina puede esterificarse, aproximadamente el 5-20% de la isoleucina puede esterificarse y aproximadamente el 25-40% de la aloisoleucina puede esterificarse. [0013] La muestra, además, puede incluir un tercer y/o cuarto estándar antes de la derivatización. El tercer y/o cuarto estándar puede ser, por ej., leucina, isoleucina y

aloisoleucina. Las formas derivatizadas del primer, segundo, tercero y (opcionalmente) cuarto estándar pueden tener diferentes pesos moleculares como resultado de un marcado diferente con átomos pesados. Las formas no derivatizadas del primer, segundo, tercero y (opcionalmente) cuarto estándar pueden tener diferentes pesos moleculares como resultado de un marcado diferente con átomos pesados. El método puede incluir otras características descritas en el presente. [0014] Se describe un método de diagnóstico de desórdenes metabólicos. El método incluye el tratamiento de una muestra, por ej., una muestra que incluya sangre, de un sujeto, en condiciones en las que los aminoácidos de cadena ramificada, por ej., la leucina, la isoleucina y la aloisoleucina, de la muestra estén derivatizados. El sujeto puede ser un humano, por ej., un recién nacido. La muestra incluye un aminoácido de cadena ramificada, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina marcado con uno o más átomos pesados como primer estándar. Tras la derivatización, se añade como segundo estándar un aminoácido de cadena ramificada derivatizado o no derivatizado, por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina que está marcado con uno o más átomos pesados. La muestra se evalúa utilizando espectrometría de masas tándem y se detectan en la muestra picos que indican formas derivatizadas y no derivatizadas, por ej., formas butiladas y no butiladas, de uno o más aminoácidos de cadena ramificada (por ej., leucina, isoleucina y aloisoleucina) . Un nivel alterado de uno o más aminoácidos de cadena ramificada en la muestra con relación al nivel en una o más muestras de referencias indica que el sujeto tiene, o corre el riesgo de desarrollar, un desorden metabólico caracterizado por niveles alterados de uno o ambos aminoácidos de cadena ramificada y de cetoácidos de cadena ramificada. [0015] El desorden metabólico puede ser, por ej., la Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce (conocida por sus siglas en inglés MSUD) , por ej., MSUD clásica, MSUD intermedia, MSUC intermitente, MSUD que responda a la tiamina, y /o MSUD

deficiente en E3. Esta afección puede, además, caracterizarse, por uno o más de los siguientes: cetoacidosis, anormalidad neurológica y alteración del desarrollo. [0016] El método, además, puede incluir la determinación de la eficacia de la derivatización de un aminoácido de cadena ramificada por remisión al primer y seguno estándar. El método, además, puede incluir la determinación de la concentración de un aminoácido de cadena ramificada en la muestra utilizando la eficacia de la derivatización. [0017] La derivatización puede ser la esterificación, por ej., llevada a cabo con un alcohol, por ej., butanol, isopropanol, etanol y metanol. El paso de la esterificación puede incluir la adaptación de uno o más parámetros, por ej., la temperatura y el

tiempo de incubación, para reducir el nivel de esterificación de uno o ambos de entre la isoleucina y la aloisoleucina.... [Seguir leyendo]

1. Un método para evaluar los isómeros moleculares de la leucina, comprendiendo este método: la derivatización de uno o más isómeros moleculares de leucina en una muestra que comprende un isómero molecular de leucina marcado con uno o más átomos pesados como un primer estándar; la adición, a la muestra, tras la derivatización, de un isómero molecular derivatizado o no derivatizado de leucina que está marcado con uno o más átomos pesados como un segundo estándar;

la evaluación de la muestra utilizando espectrometría de masas tándem; y la detección de picos indicativos de formas derivatizadas y no derivatizadas de uno o más isómeros moleculares de leucina en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1 en el que las formas derivatizadas del primer

estándar y la forma derivatizada del segundo estándar, si están presentes en forma derivatizada, tienen diferentes pesos moleculares como resultado de haberlas marcado con átomos pesados diferentes.

3. El método de la reivindicación 1 en el que el primer estándar anterior a la derivatización y el segundo estándar presente en formas no derivatizadas tienen pesos moleculares diferentes como resultado de un marcado con átomos pesados diferentes.

4. El método de la reivindicación 1 que además comprende la determinación de la eficacia de derivatización de un isómero molecular de leucina por referencia al primer 25 estándar y al segundo estándar.

5. El método de la reivindicación 4 que además comprende la determinación de la concentración de un isómero molecular de leucina en la muestra utilizando la eficacia de derivatización.

6. El método de la reivindicación 1 en el que los isómeros moleculares de leucina incluyen una o más de las siguientes: leucina, isoleucina y aloisoleucina.

7. El método de la reivindicación 1 en el que la derivatización comprende la 35 esterificación.

8. El método de la reivindicación 7 en el que la esterificación se realiza con un alcohol.

9. El método de la reivindicación 8 en el que el alcohol se selecciona de un grupo que consiste en butanol, isopropanol, etanol y metanol.

10. El método de la reivindicación 1 en el que menos del 100% de los isómeros moleculares de leucina están derivatizados.

11. El método de la reivindicación 1 en el que el primer estándar se selecciona de 10 entre el siguiente grupo: leucina, isoleucina y alo-leucina.

12. El método de la reivindicación 1 en el que el segundo estándar se selecciona de entre el siguiente grupo: leucina, isoleucina y alo-leucina.

13. El método de la reivindicación 1 en el que la detección comprende la adquisición de picos de datos que representen formas derivatizadas butiladas y no butiladas de isómeros moleculares de leucina.

14. Un método para diagnosticar la Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce (MSUD) que comprende tratar una muestra de un sujeto en condiciones en las que los isómeros moleculares de leucina de la muestra están derivatizados, comprendiendo dicha muestra un isómero molecular de leucina marcado con uno o más átomos pesados como un primer estándar;

la adición a la muestra, tras la derivatización, de un isómero molecular derivatizado o no derivatizado de leucina que está marcado con uno o más átomos pesados como un segundo estándar; la evaluación de la muestra utilizando espectrometría de masas tándem; y la detección de picos indicativos de formas derivatizadas y no derivatizadas de uno o más isómeros moleculares de leucina en la muestra en el que un nivel alterado de uno o más isómeros moleculares de leucina en la muestra con relación al nivel en una o más muestras de referencia es un indicio de que el sujeto tiene o corre el riesgo de desarrollar la Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce (MSUD) .

15. El método de la reivindicación 14 que además comprende la determinación de la

eficacia de derivatización de un isómero molecular de leucina por referencia al primer estándar y al segundo estándar.

16. El método de la reivindicación 15 que además comprende la determinación de la

concentración de un isómero molecular de leucina en la muestra utilizando la eficacia de derivatización.

17. El método de la reivindicación 14 en el que los isómeros moleculares de leucina incluyen uno o más de entre las siguientes: leucina, isoleucina y alo-leucina.

18. El método de la reivindicación 14 en el que la derivatización comprende la esterificación.

19. El método de la reivindicación 14 en el que la forma derivatizada del primer

estándar y la forma derivatizada del segundo estándar, si están presentes en forma derivatizada, tienen diferentes pesos moleculares como resultado de un diferente marcado con átomos pesados.

20. El método de la reivindicación 14 en el que el primer estándar anterior a la derivatización y el segundo estándar presente en forma no derivatizada tienen pesos moleculares diferentes como resultado de un diferente marcado con átomos pesados.

21. La utilización de un primer estándar de isómero molecular primero no derivatizado de leucina marcado con uno o más átomos pesados; y un segundo estándar de 25 isómero molecular segundo derivatizado o no derivatizado de leucina marcado con uno o más átomos pesados en el que las formas derivatizadas del primer estándar y del segundo estándar, si están presentes en forma derivatizada, tienen pesos moleculares diferentes como resultado de un diferente marcado con átomos pesados y en el que los isómeros moleculares primer y segundo no marcados de leucina tienen el

mismo peso molecular; en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. El uso de la reivindicación 21 en el que los isómeros moleculares de leucina incluyen uno o más de las siguientes: leucina, isoleucina y alo-leucina.