DETECCION DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLEX.
Un método para detectar la presencia o ausencia del virus herpes simplex (HSV) en una muestra biológica de un individuo,
dicho método comprende:
Desarrollar por lo menos una etapa de ciclo, en donde dicha etapa de ciclo comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, en donde dicha etapa de amplificación comprende poner en contacto dicha muestra con un par de cebadores de polimerasa del HSV para producir un producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV y una polimerasa de ADN del HSV que codifica la molécula de ácido nucleico está presente en dicha muestra, en donde dicha etapa de hibridación comprende poner en contacto dicho producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV con un par de sondas de polimerasa de ADN del HSV, en donde los miembros de dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV hibridan dentro de no más de 5 nucleótidos uno del otro,
En donde una primera sonda de polimerasa de ADN del HSV de dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV se etiqueta con un grupo funcional fluorescente donante y en donde una segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV de dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV se etiqueta con un grupo funcional fluorescente al sector correspondiente, y detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre dicho grupo funcional fluorescente donante y dicho grupo funcional fluorescente al sector correspondiente,
En donde la presencia de FRET es indicadora de la presencia del HSV en dicha muestra biológica, y en donde la ausencia de FRET es indicadora de la ausencia del HSV en dicha muestra biológica y en donde dicha primera sonda de polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5''-GCG CAC CAG ATC CAC GCC CTT GAT GAG C-3'' (SEQ IDNO:3), y en donde dicha segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5''-CTT GCC CCC GCAGAT GAC GCC-3'' (SEQ ID NO:4)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US02/02820.
Solicitante: MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: MAYO CLINIC 200 FIRST STREET S.W.,ROCHESTER, MN 55905.
Inventor/es: SMITH, THOMAS F., ESPY, MARK J., UHL,JAMES R, WOLD,ARLO.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/70B4
Clasificación PCT:
- C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12P19/34 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Detección del virus del herpes simplex.
Campo técnico
Esta invención se relaciona con diagnósticos víricos, y más particularmente con detección del virus del herpes simplex (HSV).
Antecedentes
El virus del herpes simplex (HSV) es el virus más comúnmente detectado en laboratorios de diagnósticos, que cuenta con más del 40% de los virus que se detectaran en cultivos celulares durante un periodo de 25-años. El HSV origina una variedad de síndromes clínicos, y los sitios anatómicos infectados incluyen la piel, labios, cavidades orales, ojos, tracto genital, y sistema nervioso central. La infección por HSV diseminada o generalizada puede ocurrir en pacientes inmunológicamente comprometidos por neoplasia, trasplante de órganos, enfermedad de inmunodeficiencia heredada, o SIDA, o a través de infección neonatal adquirida mediante transmisión del virus a través del canal de nacimiento infectado. La mayor parte de las enfermedades diseminadas es fatal.
Resumen
La invención proporciona métodos para identificar el HSV en una muestra biológica, y adicionalmente, para distinguir entre HSV-1 y HSV-2. La invención proporciona un cebador y sondas para detectar HSV y para distinguir entre HSV-1 y HSV-2, como son los equipos que contienen tales cebadores y sondas. Se pueden utilizar los métodos de la invención para identificar rápidamente el ADN del HSV de especímenes para diagnóstico de diferencial de infección del HSV. Utilizando cebadores y sondas específicas, el método incluye amplificar y monitorear el desarrollo de productos de amplificación específico que utilizan tecnología de emisión de resonancia fluorescente (FRET).
En un aspecto, la invención representa un método para determinar la presencia o ausencia del virus herpes simplex (HSV) en una muestra biológica de un individuo. El método para detectar el HSV incluye desarrollar por lo menos una etapa cíclica, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. La etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con un par de cebadores de polimerasa de ADN del HSV para producir un producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV si está presente en una molécula de ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV en la muestra. La etapa de hibridación incluye poner en contacto la muestra con un par de sondas de polimerasa de ADN del HSV. De manera general, los miembros del par de sondas de polimerasa de ADN del HSV hibridan dentro no más de cinco nucleótidos de cada uno. Una sonda de polimerasa de ADN del HSV del par de sondas de polimerasa de ADN del HSV se etiquetan típicamente con un grupo funcional fluorescente donante y una segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV del par de sondas de polimerasa de ADN del HSV se etiquetan con un grupo funcional fluorescente aceptor correspondiente. Adicionalmente El método incluye detectar la presencia o ausencia transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre el grupo funcional fluorescente donante de la sonda de polimerasa de ADN del HSV y el grupo funcional fluorescente aceptor correspondiente de la segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV. La presencia de FRET es usualmente indicadora de la presencia de HSV en la muestra biológica, aunque la ausencia de FRET es usualmente indicadora de la ausencia de HSV en la muestra biológica.
Alternativamente, o adicionalmente, la etapa de amplificación puede incluir poner en contacto la muestra con un par de cebadores TK del HSV para producir un producto de amplificación TK del HSV si está presente una molécula de ácidos nucleicos TK del HSV en la muestra. La etapa de hibridación incluye poner en contacto la muestra con un par de sondas TK del HSV. Generalmente, los miembros del par de sondas TK del HSV hibridan dentro no más de cinco nucleótidos de cada uno. Una sonda TK del HSV del par de sonda TK del HSV se etiquetan típicamente con un grupo funcional fluorescente donante y una segunda sonda TK del HSV del par de sonda TK del HSV se etiquetan típicamente con un grupo funcional fluorescente aceptor correspondiente. El método incluye adicionalmente detectar la presencia o ausencia de FRET entre el grupo funcional fluorescente donante de la primera sonda TK del HSV y el grupo funcional fluorescente aceptor de la segunda TK del HSV. La presencia de FRET es usualmente indicadora de la presencia del HSV en la muestra, aunque la ausencia de FRET es usualmente indicadora de la ausencia del HSV en la muestra.
En otro aspecto, la invención representa un método para distinguir entre HSV-1 y HSV-2 en una muestra biológica de un individuo. El método para distinguir entre HSV-1 y HSV-2 incluye desarrollar por lo menos una etapa ciclización de amplificación e hibridación. La etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con un par de cebadores de polimerasa de ADN del HSV para producir un producto de amplificación de polimerasa de ADN de HSV-1 si está presente una molécula de ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-1 en la muestra y/o un producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV-2 si está presente una molécula de ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-2 en la muestra. La etapa de hibridación incluye poner en contacto la muestra con un par de sondas de polimerasa de ADN del HSV. Los miembros del par de cebadores de polimerasa de ADN del HSV pueden hibridar secuencias dentro de una molécula de ácido nucleico que codifican la polimerasa de ADN del HSV que son idénticas entre el ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-1 y entre el ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-2, aunque las sondas de polimerasa de ADN del HSV hibriden a una secuencia que difiere entre el ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-1 y entre el ácido nucleico de polimerasa de ADN del HSV-2 mediante por lo menos un nucleótido. De manera general, una sonda de polimerasa de ADN del HSV del par de sondas de polimerasa de ADN del HSV que se etiquetan con un grupo funcional fluorescente donante, y una segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV del par de sondas de polimerasa de ADN del HSV que se etiquetan con un grupo funcional fluorescente aceptor correspondiente. El método incluye adicionalmente detectar la presencia o ausencia de FRET entre el grupo funcional fluorescente donante de la sonda de polimerasa de ADN del HSV y el grupo funcional fluorescente aceptor correspondiente de la segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV. La presencia de FRET indica usualmente la presencia de HSV en la muestra biológica, y la ausencia de FRET indica usualmente la ausencia de HSV en la muestra biológica. La temperatura de fusión se puede determinar luego entre las sondas de polimerasa de ADN del HSV y los respectivos productos de amplificación para distinguir entre HSV-1 y HSV-2.
Un par de cebadores de polimerasa de ADN del HSV incluyen general un cebador de polimerasa de ADN del HSV y un segundo cebador de polimerasa de ADN del HSV. El cebador de polimerasa de ADN del HSV puede incluir la secuencia 5'-GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C-3' (SEQ ID NO:1), y el segundo cebador de polimerasa de ADN del HSV puede incluir la secuencia 5'-CGG GGC GCT CGG CTA AC-3' (SEQ ID NO:2). La sonda de polimerasa de ADN del HSV puede incluir la secuencia 5'-GCG CAC CAG ATC CAC GCC CTT GAT GAG C- 3' (SEQ ID NO:3), y el segundo sonda de polimerasa de ADN del HSV puede incluir la secuencia 5'- CTT GCC CCC GCA GAT GAC GCC- 3' (SEQ ID NO:4). También la descripción proporciona Una sonda de polimerasa de ADN del HSV que puede incluir la secuencia 5'-GTA CAT CGG CGT CAT CTG CGG GGG CAA G- 3' (SEQ ID NO:5), y una segunda sonda de polimerasa de ADN del HSV puede incluir la secuencia 5'- T GCT CAT CAA GGG CGT GGA TCT GGT GC- 3' (SEQ ID NO:6).
Un par de Cebadores TK del HSV incluye generalmente un cebador TK del HSV y un segundo cebador TK del HSV. El cebador TK del HSV puede incluir la secuencia 5'-CAC GCT RCT GCG GGT TTA TAT AGA-3' (SEQ ID NO:7), en donde R es A o G, y el segundo cebador TK del HSV puede incluir la secuencia 5'-TTG TTA TCT GGG CGC TMG TCA TT-3' (SEQ ID NO:8), en donde M es A o C. la cebador sonda TK del HSV puede incluir la secuencia 5'-CGC GCG ACG ATA TCG TCT ACG TAC- 3' (SEQ ID NO:9), y la segunda sonda de cebador TK del HSV puede incluir la secuencia 5'-CGA GCC GAT GAC TTA CTG GCA GGT G- 3' (SEQ ID NO:10).
Los miembros de un par de sondas de polimerasa de ADN del HSV pueden hibridar dentro no más de dos nucleótidos de cada uno, o pueden hibridar dentro no más de un nucleótido de cada uno. Un grupo funcional fluorescente donante representativo es fluoresceína, y que corresponden a grupos funcionales fluorescentes aceptores que incluyen LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5, y Cy5.5. Se conocen en la técnica...
Reivindicaciones:
1. Un método para detectar la presencia o ausencia del virus herpes simplex (HSV) en una muestra biológica de un individuo, dicho método comprende:
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV comprenden una primer cebador de polimerasa de ADN del HSV y un segundo cebador de polimerasa de ADN del HSV, en donde dicha primera polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5'-GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C-3' (SEQ ID NO:1), y en donde dicho segundo cebador de polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5'-CGG GGC GCT CGG CTA AC-3' (SEQ ID NO:2).
3. El método de la reivindicación 1, en donde los miembros de dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV hibridan dentro de no más de dos nucleótidos uno del otro.
4. El método de la reivindicación 1, en donde los miembros de dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV hibridan dentro de no más un nucleótidos uno del otro.
5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho grupo funcional fluorescente donante es fluoresceína.
6. El método de la reivindicación 1, en donde dicho grupo funcional fluorescente aceptor se selecciona del grupo que consiste de LC-Red 640, LC-Red705,Cy5, y Cy5.5.
7. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección comprende excitar dicha muestra biológica a una longitud de onda absorbida mediante dicho grupo funcional fluorescente donante y visualizar y/o medir la longitud de onda emitida por dicho grupo funcional fluorescente aceptor.
8. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección comprende cuantificar dicho FRET.
9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección se desarrolla después de cada etapa de ciclo.
10. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección se desarrolla en tiempo real.
11. El método de la reivindicación 1, en donde dicho producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV difiere en secuencia entre el HSV-1 y el HSV-2 mediante por lo menos un nucleótido.
12. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente determinar la temperatura de fusión entre una o ambos de dichas sondas de polimerasa de ADN del HSV y dicho producto de amplificación de polimerasa de ADN del HSV, en donde dicha temperatura de fusión confirma dicha presencia o dicha ausencia de dicho HSV.
13. El método de la reivindicación 12, en donde dicha temperatura de fusión distingue entre el HSV-1 y el HSV-2.
14. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 10 ciclos es indicador de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
15. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 20 ciclos es indicador de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
16. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 30 ciclos es indicador de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
17. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 37 ciclos es indicador de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
18. El método de la reivindicación 1, en donde la ausencia de dicho FRET dentro de 37 ciclos es indicador de la ausencia de una infección por HSV en dicho individuo.
19. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 40 ciclos es indicadora de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
20. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de dicho FRET dentro de 50 ciclos es indicador de la presencia de una infección por HSV en dicho individuo.
21. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente: evitar la amplificación de un ácido nucleico contaminante.
22. El método de la reivindicación 21, en donde dicha prevención comprende desarrollar dicha etapa de amplificación en la presencia de uracilo.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha prevención comprende adicionalmente tratar dicha muestra biológica con glicosilato de ADN-uracilo antes de una primera etapa de amplificación.
24. El método de la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de un isótopo ocular, un espécimen genital un espécimen dérmico, una prueba de Papanicolau, un ácido amniótico y fluido cerebro espinal.
25. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de ciclo se desarrolla en una muestra de control.
26. El método de la reivindicación 25, en donde dicha muestra control comprende dicha porción de dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha polimerasa de ADN del HSV.
27. El método de la reivindicación 1, en dicha etapa de ciclo utiliza un par de cebadores de control y par de sondas de control, y en donde dichos cebadores de control y dichas sondas de control son diferentes de dichos cebadores de polimerasa de ADN del HSV y dichas sondas de polimerasa de ADN del HSV, respectivamente, en donde se produce un producto de amplificación de control si la plantilla de control está presente en dicha muestra, en donde dicha sonda de control hibrida a dicho producto de amplificación de control.
28. Un equipo, que comprende:
29. El equipo de la reivindicación 28, en donde dicho par de cebadores de polimerasa de ADN del HSV comprende un primer cebador de polimerasa de ADN del HSV y un segundo cebador de polimerasa de polimerasa de ADN del HSV, en donde dicho primer cebador de polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5'-GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C-3' (SEQ ID NO:1), y en donde dicho segundo cebador de polimerasa de ADN del HSV comprende la secuencia 5'-CGG GGC GCT CGG CTAAC-3' (SEQ ID NO:2).
30. El equipo de la reivindicación 28, en donde dicho par de sondas de polimerasa de ADN del HSV se etiquetan con dicho grupo funcional fluorescente donante y dicho grupo funcional aceptor correspondiente.
31. El método la reivindicación 1, en donde dicha amplificación en la presencia de una senda de polimerasa del HSV emplea una enzima de polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'.
32. El método la reivindicación 31, en donde dichos grupos funcionales fluorescentes aceptores y a donantes están entre no más de 5 nucleótidos uno del otro en dicha sonda.
33. El método la reivindicación 32, en donde dicho grupo funcional fluorescente aceptor es un extinguidor.
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