DETECCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LINFOCITOS T REGULADORES A TRAVÉS DEL ANÁLISIS DE METILACIÓN DEL ADN DEL GEN FOXP3.

Un procedimiento para detectar linfocitos T reguladores CD25 + CD4 + estables positivos para FoxP3 de un mamífero en una muestra obtenida de dicho mamífero,

que comprende analizar el estado de metilación de al menos una posición CpG en la región 5' cadena arriba del comienzo de transcripción, la región 5' no traducida, región promotora, intrones y/o límites exón/intrón del gen foxp3 o un gen ortólogo o parálogo del mismo, en el que la hipometilación es indicativa de un linfocito T regulador CD25 + CD4 + estable positivo para FoxP3.

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para detectar linfocitos T reguladores CD25+CD4+ positivos para FoxP3 de un mamífero, que comprende analizar el estado de metilación de al menos una posición CpG en la región 5' cadena arriba del comienzo de transcripción, regiones promotoras, intrones y/o límites exón/intrón del gen Foxp3 o un gen ortólogo o parálogo del mismo. Además, la presente invención se refiere a un kit para realizar los procedimientos anteriores así como usos respectivos.

Los linfocitos T reguladores desempeñan un papel importante para el mantenimiento de tolerancia inmunológica suprimiendo la acción de células efectoras autorreactivas, lo que les hace dianas interesantes para aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, estas células están implicadas de forma crítica en la prevención del desarrollo de reacciones autoinmunes (Sakaguchi, Nat Immunol 6:345-352, 2005).

El factor de transcripción Foxp3 se expresa específicamente en linfocitos T reguladores y se cree que actúa como un interruptor maestro para el desarrollo y función de estas células. Recientemente, se ha demostrado que la expresión ectópica de Foxp3 en linfocitos T convencionales confiere actividad supresora (Fontenot y Rudensky, Nat Immunol 6:331-337, 2005).

La vasta mayoría de linfocitos T reguladores Foxp3+ se generan durante el desarrollo de linfocitos T dentro del timo y se cree que representan un linaje individual. Además, también se ha indicado que surgen linfocitos T reguladores Foxp3+ a partir de linfocitos T convencionales tanto in vitro como in vivo tras reconocimiento del antígeno en condiciones tolerogénicas. En todos los casos la expresión de Foxp3 es característica para el desarrollo de linfocitos T reguladores.

Generalmente se desconoce qué señales conducen a la expresión de Foxp3, aunque se ha indicado que algunos factores incluyendo TGF- inducen expresión de Foxp3 en linfocitos T convencionales. Sin embargo, no está claro hasta el momento si estas condiciones solo conducen a una expresión transitoria o a diferenciación terminal en linfocitos T reguladores Foxp3+, lo que se requiere para función supresora a largo plazo de estas células. Por lo tanto, el punto de partida para la presente invención fue el análisis de mecanismos que conducen a expresión estable del factor de transcripción de Foxp3 en linfocitos T reguladores.

El documento WO 02/090600 describe moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican Fkhsf, así como formas mutantes de la misma. También se describen vectores de expresión adecuados para expresar tales moléculas de ácido nucleico y células huésped que contienen tales vectores de expresión. También se describen compuestos y procedimientos farmacéuticos para identificar tales compuestos que pueden modular el sistema inmune. Además se proporcionan procedimientos para identificar proteínas reguladas por Escurfina y proteínas que inducen o inhiben la expresión de Foxp3.

Chen y col. (Chen L, Cohen AC, Lewis DB. Impaired Allogeneic Activation and T-helper 1 Differentiation of Human Cord Blood Naive CD4 T Cells. Biol Blood Marrow Transplant. Feb 2006;12(2):160-71.) describen la expresión de proteína FoxP3 como un marcador para linfocitos T reguladores CD25(alto) CD4.

El documento EP-A-1 213 600 describe materiales para la generación de identificadores de metilación de células particulares.

El documento WO2004/050706 desvela los fenotipos de expresión de linfocitos T reguladores. Un fenotipo se define por la expresión combinada de FoxP3 además de CD4, CD25 y CCR5. Los análisis se basan en FACS y/o análisis de anticuerpo.

El documento US2003/170648 desvela un procedimiento para identificar un compuesto que modula el nivel de expresión de escurfina (FoxP3) usando un gen indicador ligado a un promotor de escurfina en el fondo de un gen foxP3 mutado.

Aunque casi todas las células en un individuo contienen exactamente el mismo complemento de código de ADN, los organismos superiores deben imponer y mantener diferentes patrones de expresión génica en los diversos tipos tisulares. La mayor parte de la regulación génica es transitoria, dependiendo del estado actual de la célula y cambios en estímulos externos. La regulación consistente, por otro lado, es un papel principal de epigenética, patrones reguladores hereditarios que no alteran la codificación genética básica del ADN. La metilación de ADN es la forma arquetípica de regulación epigenética; sirve como la memoria estable para células y realiza un papel crucial en el mantenimiento de identidad a largo plazo de diversos tipos celulares.

La diana principal de metilación es la secuencia de dos nucleótidos Citosina-Guanina (un “sitio CpG”); dentro de este contexto la citosina (C) puede experimentar una simple modificación para convertirse en 5-metil-citosina. En el genoma humano, la secuencia CG es mucho menos común de lo esperado excepto en ciertos grupos relativamente densos llamados “islas de CpG”. Las islas de CpG se asocian frecuentemente con promotores génicos y se ha estimado que más de la mitad de los genes humanos tienen islas de CpG (Antequera y Bird, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:11995-9, 1993).

**(Ver fórmula)**

La metilación aberrante de ADN frecuentemente acompaña la transformación de células sanas a cancerosas. Entre los efectos observados están hipometilación en todo el genoma, metilación aumentada de genes supresores de tumores e hipometilación de muchos oncogenes (revisado por Jones y Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Se ha reconocido que los perfiles de metilación son específicos de tumor (es decir, cambios en el patrón de metilación de genes particulares o incluso CpG individuales son diagnósticos de tipos tumorales particulares) y existe ahora una colección exhaustiva de marcadores de diagnóstico para cánceres de vejiga, mama, colon, esófago, estómago, hígado, pulmón y próstata (resumidos por Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).

El control epigenético por metilación es esencial para el desarrollo temprano incluyendo embriogénesis, inactivación del cromosoma X e impronta (silenciamiento monoalélico) del alelo paterno o materno (Erlich, J Cellular Chem 88: 899-910, 2003). También existe una clase de genes que se activa en la línea germinal, pero se silencia por metilación en células somáticas (Bird, Genes and Dev 16:6-21, 2002; Li, Nature Reviews/Genetics 3:662-673, 2002).

La metilación específica de tejido también actúa en la regulación de etapas/tipos celulares adultos y en algunos casos se ha establecido una relación causal entre metilación y expresión génica. Las siguiente es una lista parcial de genes, para los que los cambios de metilación están fuertemente implicados en el control de la expresión génica de una manera específica de tejido: lactato deshidrogenasa C (testículos); Receptor de oxitocina (sangre e hígado); Tirosina aminotransferasa (hígado); GFAP (astrocitos) y Leucosialina (leucocitos). En otros casos, la metilación puede ser un producto secundario de alguna otra regulación primaria o se requiere para bloquear el gen en el estado “inactivado” (Erlich, J Cellular Chem 88:899-910, 2003). Para las presentes aplicaciones (identificación celular/tisular), no se requiere una relación causal, únicamente una fuerte correlación entre patrones de metilación y tipos celulares.

Un ejemplo previamente publicado para una modificación específica tal de estado celular y tipo celular de ciertas regiones génicas se encuentra durante el compromiso de linaje de linfocitos T a linfocitos T auxiliares (Th1 o Th2). Los linfocitos T CD4+ vírgenes (no estimulados) se activan tras encontrarse con un antígeno y pueden comprometerse a destinos celulares alternativos a través de estimulación adicional por interleucinas. Los dos tipos de linfocitos T auxiliares muestran patrones recíprocos de expresión génica; Th1 produce Interferon-gamma (IFN-) y silencia IL-4, mientras que Th2 produce IL-4 y silencia IFN- (Ansel y col., Nature Immunol 4:616-623, 2003). Para ambos destinos celulares alternativos, la expresión de estos genes se relaciona inversamente con metilación de sitios CpG proximales. En linfocitos T vírgenes y Th2 el promotor de IFN- está metilado, pero no en linfocitos Th1 en los que se expresa IFN- (Attwood y col., CMLS 59:241-257, 2002). Por el contrario, la región transcrita completa de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar linfocitos T reguladores CD25+CD4+ estables positivos para FoxP3 de un mamífero en una muestra obtenida de dicho mamífero, que comprende

analizar el estado de metilación de al menos una posición CpG en la región 5' cadena arriba del comienzo de transcripción, la región 5' no traducida, región promotora, intrones y/o límites exón/intrón del gen foxp3 o un gen ortólogo o parálogo del mismo,

en el que la hipometilación es indicativa de un linfocito T regulador CD25+CD4+ estable positivo para FoxP3.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende amplificación con al menos uno de los pares de cebadores seleccionados de SEC ID Nº 1 y 2; SEC ID Nº 3 y 4; SEC ID Nº 5 y 6; SEC ID Nº 7 y 8, SEC ID Nº 9 y 10; SEC ID Nº 11 y 12; SEC ID Nº 13 y 14; SEC ID Nº 15 y 16; SEC ID Nº 17 y 18; SEC ID Nº 19 y 20; SEC ID Nº 21 y 22; SEC ID Nº 23 y 24; SEC ID Nº 25 y 26; SEC ID Nº 27 y 28; SEC ID Nº 29 y 30 y pares de cebadores ortólogos o parálogos de los mismos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende amplificación con al menos uno de los pares de cebadores seleccionados de SEC ID Nº 1 y 2; SEC ID Nº 3 y 4; SEC ID Nº 15 y 16; SEC ID Nº 17 y 18, SEC ID Nº 19 y 20; SEC ID Nº 21 y 22; SEC ID Nº 23 y 24; SEC ID Nº 29 y 30 y pares de cebadores ortólogos o parálogos de los mismos, preferentemente SEC ID Nº 17 y 18 y pares de cebadores ortólogos o parálogos del mismo.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende analizar el estado de metilación de al menos una posición CpG seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 38, 74, 90, 124, 151, 156, 205, 224, 228, 236, 298 y 368 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 1 y 2, las posiciones 158, 180, 308, 344, 360, 394, 421 y 426 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 3 y 4, las posiciones 37, 69, 311, 315, 319, 338 y 371 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 5 y 6, las posiciones 93, 170, 173, 176 y 281 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 7 y 8 y posiciones CpG ortólogas o parálogas de las mismas.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende analizar el estado de metilación de al menos una posición CpG seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 38, 74, 90, 124, 156, 205, 224, 236, 298 y 368 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 1 y 2, posiciones 180, 308, 344 y 394 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 3 y 4 y posiciones CpG ortólogas o parálogas de las mismas.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende un procedimiento seleccionado de digestiones enzimáticas específicas de metilación, secuenciación por bisulfito, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE u otros procedimientos que se basan en una detección de ADN amplificado.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho mamífero es un ratón, rata, mono o ser humano.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente una inducción con TGF-.

9. Un procedimiento in vitro para identificar sustancias químicas y/o biológicas que modulan la expresión de foxp3 en un linfocito T, que comprende poner en contacto una o más de dichas sustancias químicas y/o biológicas con un linfocito T, realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y detectar si dicha sustancia química y/o biológica modula la metilación de las posiciones CpG como se ha analizado.

10. El procedimiento para identificar sustancias químicas y/o biológicas de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha sustancia proporciona una desmetilación de las posiciones CpG como se ha analizado en al menos 80 %, preferentemente 90 % y más preferentemente 95 %.

11. Un kit para identificar linfocitos T reguladores basándose en el análisis del estado de metilación de las posiciones CpG en el gen foxp3, que comprende un reactivo de bisulfito, protocolos de procedimiento y sondas oligonucleotídicas para el análisis de metilación de las posiciones CpG seleccionadas de las posiciones que consisten en las posiciones 38, 74, 90, 124, 156, 205, 224, 236, 298 y 368 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 1 y 2, las posiciones 180, 308, 344 y 394 del amplicón como se amplificó por el par de cebadores SEC ID Nº: 3 y 4 y posiciones CpG ortólogas y parálogas de las mismas.

12. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 11 para detectar y/o identificar linfocitos T reguladores CD25+CD4+ estables positivos para FoxP3.