DESINFECCIÓN DE PRIONES.

CAMPO TECNICO La invención se refiere a composiciones y métodos para la inactivación de priones y a medios para desinfectar materiales contaminados por los priones o por proteínas similares conformacionalmente alteradas. ANTECEDENTES E02709900 20-10-2011 Históricamente, los agentes infecciosos como por ejemplo las bacterias, hongos, parásitos y viroides tienen métodos de control bien establecidos que implican varias formas de desinfección y esterilización (por ejemplo, esterilización por vapor, esterilización en seco, pasteurización, filtración estéril, tratamiento con óxido de etileno, glutaraldehido, fenoles, u otras substancias químicas desinfectantes, radiación, etc.). Con los virus se han establecido también métodos como por ejemplo, la disminución del pH a 4,0 ó inferior, calentando a 60 °C durante períodos prolongados, o el empleo de disolventes orgánicos en altas concentraciones. Además, han sido empleados el tratamiento con radiación UV, con formaldehído y con agentes específicos antivíricos. Desde hace algunos años, han aparecido nuevas y anteriormente desconocidas especies de agentes patogénicos que han sido dados a conocer en publicaciones científicas. Estos han recibido el nombre de priones y hoy en día constituyen uno de los mayores desafíos de cara a la industria del cuidado de la salud. Los priones son partículas infecciosas diferentes de las bacterias y de otros agentes infecciosos anteriormente conocidos. Aunque no existe ninguna firme evidencia sobre la exacta estructura de los priones, un número de enfermedades han sido identificadas recientemente tanto en seres humanos como en animales, que parecen ser imputables a los priones. Como se detalla en la patente internacional PCT/US00/14353 (el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia) las enfermedades humanas atribuidas a los priones incluyen el Kuru, la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob (CJD), la enfermedad de Gertsmann-Straussler-Scheinker (GSS), y el llamado insomnio familiar fatal (FFI). Además de las enfermedades de los priones en humanos, trastornos de los animales se incluyen en el grupo de enfermedades conocidas de los priones. La tembladera de las ovejas y cabras es la enfermedad animal causada por priones más estudiada. Varias líneas de investigación han sugerido una conexión entre la variante CJD y una epidemia anterior de encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Ningún tratamiento terapéutico con éxito ha sido desarrollado y como resultado, estas enfermedades resultan siempre fatales. Adicionalmente al problema, existe el hecho de que el período de incubación puede ser de hasta 30 años en los humanos y este factor presenta implicado un mayor desafío a los científicos, con algunos que predicen una epidemia "in the pipeline" ("en la tuberia"). Los grupos con posibilidad de riesgo de infección incluyen pacientes que pueden haber tenido contacto con instrumentos médicos infectados durante la cirugía, el equipo médico que disecciona material infectado, y trabajadores de la salud responsables de la limpieza e instrumentos de esterilización. Existe también la preocupación de que los grupos de riesgo se amplien para incluir veterinarios, trabajadores de los mataderos, carniceros en contacto con vacas o bueyes, primordialmente en Europa y más recientemente aquellas personas que han recibido transfusiones sanguíneas u órganos de donadores que incubaban una enfermedad por priones. La estructura de los priones ha sido el objeto de intensas investigaciones y se han dado a conocer diferentes puntos de vista. Algunos científicos creen que son virus extremadamente pequeños, mientras que la mayor parte de expertos creen que los priones son en realidad proteínas infecciosas sin un núcleo de ADN ó ARN. Más particularmente, el consenso ahora es que el gen PrP de los mamíferos expresa una proteína que puede ser la forma celular soluble PrP c , no causante de la enfermedad, o puede ser una forma insoluble PrP sc causante de la enfermedad. Muchas líneas de evidencia indican que las enfermedades por priones son el resultado de la transformación de la forma celular normal en la forma anormal PrP Sc . No existe ninguna diferencia detectable en la secuencia de aminoácidos de las dos formas. La forma PrP c se compone de una proteína de 33-35 kDa altamente asociada a la membrana, la cual proteína se degrada durante la digestión mediante la proteasa K. Sin embargo, la forma PrP Sc tiene una forma conformacional alterada, en particular tiene un alto nivel de conformación de láminas de ß. Las propiedades de la PrP Sc de utilidad en el diagnóstico de la forma infecciosa conformacionalmente alterada son un núcleo resistente a la proteasa de 27-30 kDa. Otra característica distintiva de la forma infecciosa conformacionalmente alterada es que la misma adquiere un núcleo hidrofóbico. Los agentes convencionales de desinfección y esterilización no tienen ningún efecto significativo sobre los priones en un tiempo aceptable. Las tentativas para desactivar los priones y/o desinfectar las superficies sobre las cuales podrían ser transmitidos han demostrado una extraordinaria resistencia. Las condiciones requeridas son generalmente demasiado severas para ser prácticas para la desinfección rutinaria, no solamente en términos de tiempo y de coste sino también en términos de daños a los materiales y los riesgos ocupacionales de la salud implicados. Por ejemplo en un estudio, se han detectado partículas infecciosas de PrP 2 Sc en una muestra después de 5-15 minutos/600 °C de calor seco aunque la total destrucción pudo lograrse a 1000 °C en 15 minutos y en 1-10 horas a > 200ºC. Se ha propuesto un tratamiento con sosa cáustica 1M (pH 14) durante 2 horas pero dicho   tratamiento es extremadamente corrosivo, peligroso para el personal, y agresivo para los materiales. La patente US 5633349 describe un procedimiento para el tratamiento de un material biológico que comprende el tratamiento con urea 6-8 molar ó 1-2 molar de tiocianato de sodio durante un mínimo de 12 horas (de preferencia 18 horas) el cual tiene las mismas desventajas. Debido a las dificultades de descontaminación, se ha propuesto como preferente para los instrumentos quirúrgicos empleados en la cirugía cerebral, que deben ser empleados solamente una vez, pero esto implica un riesgo de eliminación, además de que es caro e impracticable para algunos instrumentos. La patente internacional PCT/US00/14353 describe un método que convierte los priones en no infecciosos mediante el empleo de un dendrímero policatiónico, pero no está claro si dicho proceso es reversible o permanente o comercialmente viable para la desinfección de superficies. Aunque la atención se ha enfocado sobre la forma PrP c y la forma PrP Sc , se ha sugerido también que la proteína puede existir en una forma intermedia la cual tiene un contenido en láminas ß intermedio entre la estructura de hélice alfa predominante en la forma PrP c y la conformación predominante de láminas ß en la forma PrP Sc la cual retiene la solubilidad en ausencia de un desnaturalizante. El montaje o mal montaje de las proteínas normalmente solubles, en proteínas insolubles conformacionalmente alteradas, se piensa que es causa de, o implica, una variedad de otras enfermedades. Aunque la invención se describirá en la presente en relación con los priones , se comprenderá que es aplicable a otras proteínas o enzimas resistentes insolubles conformaciónalmente alteradas, implicadas en la enfermedad. La descripción anterior de la técnica antigua no se ha efectuado como una admisión con respecto al conocimiento común general en Australia. Un objetivo de la invención es el de proporcionar unos medios perfeccionados, o por lo menos alternativos, de desinfectar una superficie infectadada con priones. En ciertas versiones preferidas la invención convierte a los priones en inactivos más eficazmente, es decir más efectivamente en un tiempo dado, o con eficacia en un tiempo más corto que los métodos de la técnica antigua. Ciertas versiones altamente preferidas de la invención consiguen una reducción en más de 4 log en menos de 60 minutos por debajo de 60 °C. En algunas versiones de la invención, es también aplicable a los priones en situaciones distintas a las de encima de las superficies por ejemplo en una suspensión en un medio sólido, líquido o gaseoso o sistemas biológicos y puede tener otros empleos in vitro o in vivo. Es un objetivo de algunas de las descripciones de la solicitud el proporcionar herramientas de diagnóstico perfeccionadas y otras versiones para proporcionar nuevos epímeros para la preparación de anticuerpos. El término "proteína prión" como se emplea en la presente, incluye variantes, fragmentos, fusiones, y análogos que tienen otras interacciones o actividades que son substancialmente las mismas que los de una secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un método no terapéutico de desinfección, que comprende los pasos de tratamiento de una superficie, de una suspensión o de una solución contaminada con una proteína prión PrP Sc ó un substituto de la misma simultáneamente con una combinación de (1) subtilisin Carlsberg, y (2) ó : a) ácido dodecilbenzenosulfónico (DOBS) Teric 164 y sonicación; b) dodecilsulfato de sodio (SDS), Empigen BS/AU y sonicación; c) SDS, bórax y una temperatura aumentada hasta 150 °C; d) DOBS y Triton X100; ó e) sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración a la cual el desplegado es irreversible; en donde el DOBS, SDS, DMSO, la temperatura y la sonicación favorecen el desplegado conformacional de la proteína prión PrP Sc , mientras que no desnaturalizan el subtilisin Carlsberg, y el Teric 164, el Empigen BS/AU, el bórax y el Triton X 100 promueven o protegen el plegado del subtilisin Carlsberg, sin impedir la escisión de la proteína prión. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tratamiento se selecciona de forma que después de la escisión resulte un predeterminado porcentaje de fragmentos de proteína que tienen un peso molecular inferior a un peso molecular predeterminado. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en donde por lo menos un 90% de fragmentos de proteína después de la escisión tienen un peso molecular inferior a 27 kDa. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en donde por lo menos un 90% de fragmentos de proteína después de la escisión tienen un peso molecular inferior a 25 kDa. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en donde por lo menos un 90% de fragmentos de proteína después de la escisión tienen un peso molecular inferior a 23 kDa. 6. Un métodos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las condiciones se seleccionan para proteger o replegar la subtilisin Carlsberg, desplegando de manera irreversible o por lo menos abriendo el prión de manera suficiente para que sea accesible a la subtilisin Carlsberg. 7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que incluye además la combinación de uno o más agentes seleccionados para favorecer el desplegado conformacional seleccionado entre el grupo formado por la irradiación, el campo eléctrico, el campo magnético, la vibración energética, y combinaciones de los mismos. 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la vibración energética es uno o varios de los ultrasonidos, la vibración electromagnética o la vibración mecánica. 9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, que incluye además en la combinación uno o varios agentes seleccionados para promover el desplegado seleccionados del grupo formado por el calor, el pH, los disolventes orgánicos de la clase que tienen tendencia a desnaturalizar las proteínas, los agentes caotrópicos, los surfactantes con tendencia a unirse con las proteínas, las sales inorgánicas que son fuertes desnaturalizantes de las proteínas, agentes que provocan la escisión del enlace S S , las substancias que tienen una fuerte afinidad para los residuos hidrófílos de los aminoácidos, las substancias que tienen una fuerte afinidad para los residuos hidrófobos de los aminoácidos, las substancias que promueven la adsorción sobre las superficies y combinaciones de los citados. 10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que incluye además en la combinación uno o varios agentes de plegado seleccionados entre el grupo formado por los disolventes nucleófílos, los disolventes estabilizadores débilmente próticos, los surfactantes no iónicos, los surfactantes iónicos, los surfactantes bipolares y anfóteros, los tampones, los surfactantes homopolímeros, copolímeros o copolímeros en bloques, compuestos sulfatados, desoxicolato, glicosaminoglicanos y combinaciones de los citados. 11. Una composición para el tratamiento de una superficie contaminada con una proteína prión PrP Sc ó un substituto de la misma, la cual comprende: (1) subtilisin Carlsberg, y (2) ó E02709900 20-10-2011   a) DOBS y Teric 164; b) SDS y Empigen BS/AU; c) SDS y bórax; d) DOBS y Triton X100; ó e) DMSO a una concentración a la cual el desplegado es irreversible, en donde los DOBS, SDS y el DMSO, favorecen el desplegado conformacional de la proteína prión PrP Sc , sin desnaturalizar el subtilisin Carlsberg, y el Teric 164, el Empigen BS/AU, el bórax y el Triton X 100 promueven o protegen el plegado de la subtilisina Carlsberg, sin impedir la escisión de la proteína prión. 12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente se selecciona de manera que después de la escisión resulte un predeterminado porcentaje de fragmentos de proteína que tengan un peso molecular inferior a un peso molecular predeterminado. 13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente se selecciona de manera que después de la escisión resulte por lo menos un 90% de los fragmentos de proteína con un peso molecular inferior a los 27 kDa. 14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente se selecciona de manera que después de la escisión resulte por lo menos un 90% de los fragmentos de proteína con un peso molecular inferior a los 25 kDa. 15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente se selecciona de manera que después de la escisión resulte por lo menos un 90% de los fragmentos de proteína con un peso molecular inferior a los 23 kDa. 11 E02709900 20-10-2011