Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos.

Un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de unamutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37,

en la que dicha mutación es unamutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/016308.

Solicitante: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, THE DEPARTMENT OF.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, 6011 EXECUTIVE BOULEVARD, SUITE 325 ROCKVILLE, MD 20852-3804 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MURPHY, BRIAN, R., WHITEHEAD,STEPHEN,S, HANLEY,KATHRYN A, BLANEY,JOSEPH E. JR.

Fecha de Publicación: 1 de Abril de 2013.

Clasificación Internacional de Patentes:

A61K39/12 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Antígenos virales.
A61K39/42 A61K 39/00 […] › virales.
C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
C12N7/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
C12N7/04 C12N […] › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Inactivación o atenuación; Producción de partes elementales de virus.
C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
C12Q1/70 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
G01N33/48 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

PDF original: ES-2399420_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos Campo de la invención Se desarrolló un menú de mutaciones que es útil en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de 5 vacunas del virus del dengue.

Antecedentes de la invención El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue está ampliamente distribuido en todas las regiones tropicales semitropicales del mundo y se transmite a los seres humanos por mosquitos vectores. El virus del dengue es una causa principal de 10 hospitalización y muerte en niños en al menos otro países asiáticos tropicales (WHO, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment prevention and control -2ª ed. Geneva: WHO) . Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) que anualmente provocan 50 -100 millones de casos estimados de fiebre por dengue y 500.000 casos de la forma más grave de la infección por el virus del dengue, fiebre hemorrágica por dengue/síndrome que choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70) . La 15 DHF/DSS se ve predominantemente en niños y en adultos que experimentan una segunda infección por el virus del dengue con un serotipo diferente al de su primera infección por el virus del dengue y en una infección principal en lactantes que aún tienen anticuerpos maternos específicos del dengue en circulación (Burke, D.S. et al. 1988 Am JTrop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72) . Se necesita una vacuna para disminuir el grado de enfermedad provocada por el virus del 20 dengue, pero no está disponible ninguna. Debido a la asociación de una enfermedad más grave con una infección por el virus del dengue secundaria, una vacuna exitosa debe inducir inmunidad para los cuatro serotipos. La inmunidad está mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glucoproteína E de la envoltura, una proteína estructural viriónica. La infección con un serotipo induce inmunidad homotípica de larga duración y una inmunidad heterotípica de corta duración (Sabin, A. 1955 Amer J Trop Med Hyg 4:198-207) . Por lo 25 tanto, el objetivo de la inmunización es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, que se puede lograr mejor económicamente usando vacunas de virus vivos atenuados. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna atenuada para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 en: Fields B.N. et al. eds. Fields Virology Philadelphia: Lippincott-Ravan Publishers, 961-1034) .

Se han desarrollado y evaluado diversos candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado en seres humanos o en primates no humanos. Los primeros candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado fueron mutantes de la gama de huéspedes desarrollados por el paso en serie de virus del dengue naturales en los cerebros de ratones y la selección de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. & Hotta, S. 1944 Japanese J Bacteriology 1:9635 99; Sabin, A.B. & Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisseman, C.L. Jr. et al. 1963 Am J Trop Med 12:620623) . Aunque estos virus de vacunas candidatas fueron inmunógenos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular evitó un desarrollo posterior. Se han desarrollado candidatos a vacunas de DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 vivos atenuados adicionales por el paso en serie en cultivo de tejidos (Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immim 31:698-703; 40 Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-95; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-26; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:317988) o por mutagénesis química (McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42) . Se ha demostrado que es muy difícil lograr un equilibrio satisfactorio entre la atenuación y la inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e 45 inmunógena de forma satisfactoria contra cada uno de los cuatro virus del dengue (Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Supl 2: 44-7) .

Recientemente, dos avances principales que utilizan tecnología de ADN recombinante han hecho posible el desarrollo de candidatos a vacunas del virus del dengue vivo atenuado prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado procedimientos para recuperar virus del dengue infecciosos a partir de células transfectadas con 50 transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo posible de este modo derivar virus infecciosos que llevan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc por mutagénesis dirigida a sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43) . En segundo lugar, es posible producir virus quiméricos antigénicos en los que la región codificante de proteína estructural del clon de ADNc de longitud complete se reemplaza por la de un serotipo del virus del dengue diferente o de un flavivirus más divergente 55 (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-90; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95:1746-51) . Estas técnicas se han usado para construir virus del dengue quiméricos intertípicos que han demostrado que son eficaces en la protección de monos contra un desafío de virus del dengue homólogo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6) :

Los datos de secuencias del clon recombinante del virus del dengue de tipo 4, rDEN4del30 y rDEN4 se pueden recuperar de la base de datos de NCBI, número de referencia: AF326827 y AF326825, respectivamente. Los mutantes de deleción en la región no codificante 3' del virus del dengue de tipo 4 se describieron en Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-37. Además, un virus del dengue de tipo 4 recombinante como candidato a vacuna con una deleción en la 3' UTR (que abarca los nucleótidos de 173 a 142 del extremo 3' terminal) se describió por Durbin, A.P.

2000 Clin Infect Dis 31: 223.

A pesar de estos avances, existe una necesidad de desarrollar vacunas de virus del dengue atenuado antigénicas que especifiquen un equilibrio satisfactorio ente la atenuación y la inmunogenicidad para los seres humanos.

Sumario de la invención Se describen mutaciones que confieren sensibilidad a la temperatura en células Vero o células de hígado humanas,

restricción huésped-célula en células de hígado humanas o de mosquito, adaptación huésped-célula para la replicación mejorada en células Vero, o la atenuación en ratones, mutaciones que son útiles en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de las vacunas del virus del dengue.

La invención proporciona en un primer aspecto un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de una mutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37, en la que dicha mutación es una mutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el virus del dengue de acuerdo con la presente invención y su uso para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue. Se proporciona además un procedimiento de preparación de un virus del dengue de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra el crecimiento de DEN4 2A wt y del candidato a vacuna, 2AΔ30, en células Vero y HuH-7. Se infectaron células Vero (A) o HuH-7 (B) con DEN4 2A o 2AΔ30 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 o 0, 01. Se lavaron monocapas de células confluentes en matraces de cultivo de tejidos de 25 mm y se recubrieron con un inóculo de 1, 5 ml que contenía el virus indicado. Después de una incubación de dos horas a 37 ºC, se lavaron tres veces las células en PBS y se añadieron 7 ml de medio de cultivo complementado con FBS al 2 %. Se retiró una alícuota de 1 ml de medio de cultivo de tejido, se reemplazó con medio recién preparado y se designó el punto temporal de 0 horas.

En los puntos temporales indicados post-infección, se retiraron muestras de medios de cultivo de tejido y se congelaron a -70 ºC. Se... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de una mutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37, en la que dicha mutación es una mutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201.

2. El virus del dengue de la reivindicación 1, que comprende además la mutación delta30.

3. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 1.

4. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 2.

5. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 3.

6. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 4.

7. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus quimérico.

8. El virus quimérico de la reivindicación 7 que tiene un esqueleto de dengue 1, un esqueleto de dengue 2, un esqueleto de dengue 3 o un esqueleto de dengue 4.

9. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 en un envase o dispositivo dispensador e instrucciones para su administración.

11. Uso de un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacológicamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue, en el que dicha composición se va a administrar a un sujeto.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que dicha administración es por inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular.

13. Una vacuna tetravalente que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.

14. Una vacuna de virus vivo atenuado que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.

15. La vacuna de virus vivo atenuado de la reivindicación 14 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadament.

10. 109 unidades formadoras de placa (PFU) /ml.

16. Una vacuna inactivada que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.

17. La vacuna inactivada de la reivindicación 16 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadamente 0, 1 hasta 50 μg de proteína E/ml.

18. Una molécula de ADNc que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

19. Una molécula de ARN que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

20. Un procedimiento de preparación de un virus del dengue que comprende

(a) sintetizar ARN genómico vírico de longitud completa in vitro usando una molécula de ADNc que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(b) transfectar células cultivadas con el ARN genómico vírico para producir virus; y

21. Un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende combinar un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

22. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que las mutaciones de carga-agrupada-a-alanina son en los aminoácidos 2687 y 2688 del polipéptido codificado por el gen NS5 del virus del dengue de tipo 4.

, 01 , 01

DEN4 2A

Mutagénesis de 5-FU 1 mM en células Vero Disminución de 100 veces en el valor vírico Dilución terminal 1x

1.248 clones de virus viables en células Vero

Cribado para fenotipo ts Células Vero Células HuH-7 (riñón de mono) (hepatoma humano)

Dilución terminal 2x Confirmación de fenotipos

ts en ambas células: 13 clones de virus ts sólo en HuH-7: 7 clones de virus Figura 2

Patentes similares o relacionadas:

Dispositivos modulares para puntos de atención y usos de los mismos, del 29 de Julio de 2020, de Labrador Diagnostics LLC: Un sistema para la detección automatizada de un analito a partir de una muestra de fluido corporal, que comprende: un dispositivo de fluidos que comprende: […]

Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]

Anticuerpos del OPGL, del 15 de Julio de 2020, de AMGEN FREMONT INC.: Un anticuerpo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde: a) la cadena pesada comprende: 1) una secuencia de aminoácidos recogida […]

ANTICUERPO MONOCLONAL O UNA PORCIÓN DE UNIÓN A ANTÍGENO DEL MISMO QUE SE UNE A LA PROTEÍNA L DEL VIRUS PARAINFLUENZA HUMANO (PIV); MÉTODO Y KIT PARA DETECTAR AL VIRUS PIV, del 2 de Julio de 2020, de PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE: La invención presenta la generación de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína L del virus parainfluenza humano (PIV), donde dichos […]

ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO PB2 DEL VIRUS DE LA INFLUENZA HUMANA (FLU), SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS; MÉTODO Y KIT DE DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN PRODUCIDA POR FLU, del 2 de Julio de 2020, de PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE: La invención presenta la generación de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína PB2 del virus de la influenza humana (Flu), […]

Dispositivo para la detección de analitos, del 1 de Julio de 2020, de TECHLAB, INC.: Un dispositivo para detectar por lo menos una sustancia de interés en una muestra líquida, comprendiendo el dispositivo: (a) una unidad que […]

Un ensayo de la respuesta inmunológica mediada por células, del 17 de Junio de 2020, de Cellestis Limited: Un método para medir una actividad de respuesta inmunológica mediada por células, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar una composición de incubación […]

Método de deducción de un valor de positividad de biomarcador en porcentaje para células seleccionadas presentes en un campo de visión, del 10 de Junio de 2020, de NOVARTIS AG: Método de deducción de un valor para el % de positividad de biomarcador (PBP) para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las […]