Procedimiento para la preparación de un polisacárido K5 N-desacetilado,

N,O-sobresulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60%, que tiene un grado de sulfatación de desde 4 hasta 4,6 (derivado de epiK5-N,Osobresulfato), caracterizado porque (a) un polisacárido K5 N-desacetilado, N-sulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60%, (derivado de epiK5-N-sulfato) que tiene un peso molecular medio de desde 1.000 hasta 25.000, en forma ácida, se trata con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando que la mezcla de reacción repose durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos a un pH de 7 y se aísla su sal con dicha base orgánica; (b) dicha sal de base orgánica de dicho derivado de epiK5-N-sulfato se trata con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de O-sobresulfatación; (c) el polisacárido K5 N-desacetilado, O-sobresulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60% (derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato), que tiene un grado de sulfatación de desde 3,55 hasta 3,8 así obtenido se somete a N-sulfatación mediante métodos conocidos y se aísla el derivado de epiK5-N,Osobresulfato así obtenido

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos derivados de polisacárido K5 con un grado de sulfatación muy alto, a un procedimiento para su preparación, a nuevos productos intermedios altamente O-sulfatados útiles en su síntesis y a composiciones farmacéuticas que contienen dichos derivados de polisacárido K5 como principios activos 5 básicamente libres de actividad en la coagulación.

En particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de epiK5-N,O-sobresulfatos partiendo de un polisacárido K5, previamente N-desacetilado, N-sulfatado y epimerizado en C5 al menos el 20%, mediante la O-sobresulfatación en condiciones adecuadas y posterior N-sulfatación, a dichos epiK5-N,O-sobresulfatos de actividad antiangiogénica y antiviral y a nuevos productos intermedios de epiK5-N-sulfatos de bajo peso molecular. 10

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los glicosaminoglicanos tales como heparina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina y ácido hialurónico son biopolímeros que se extraen industrialmente de diversos órganos animales.

En particular, la heparina, principalmente obtenida mediante la extracción de la membrana mucosa intestinal de cerdos o pulmón de bovino, es un copolímero polidisperso con una distribución de peso molecular de desde 15 aproximadamente 3.000 hasta aproximadamente 30.000 D que consiste en una mezcla de cadenas que consisten básicamente en un ácido urónico (ácido glucurónico o ácido idurónico) y en un aminoazúcar (glucosamina) unidos mediante enlaces -14 o -14. En la heparina, la unidad urónica puede estar O-sulfatada en la posición 2 y la unidad de glucosamina está N-acetilada o N-sulfatada, 6-O-sulfatada y 3-O-sulfatada en aproximadamente el 0,5% de las unidades de glucosamina presentes. 20

Las propiedades y la biosíntesis natural de la heparina en mamíferos se han descrito por Lindahl et al., 1986 en Lone. D. y Lindahl, U. (Editores) “Heparin. Chemical and Biological Properties; Clinical Applications”, Edward Arnold. Londres, páginas 159-190, por Lindahl, U. Feingold D. S. y Rodén L. 1986 TIBS. 11, 221-225 y por Conrad H. E. “Heparin Binding Proteins”, Chapter 2: Structure of Heparinoids. Academic Press, 1998. La biosíntesis de heparina se produce partiendo de su precursor N-acetil-heparosano que consiste en una mezcla de cadenas que consisten en 25 la unidad de repetición de disacárido glucuronil--14-N-acetilglucosamina. Dicho precursor experimenta modificaciones enzimáticas que hidrolizan parcialmente el grupo N-acetilo, sustituyéndolo con un grupo SO3-, epimeriza el carboxilo en la posición 5 de una parte de las unidades glucurónicas convirtiéndolas en unidades idurónicas e introduciendo grupos O-sulfato para obtener un producto que, una vez extraído industrialmente, tiene aproximadamente el doble del número de grupos sulfato con respecto a los carboxilo por unidad de disacárido. 30 Estas modificaciones enzimáticas conducen, además, a la formación de la región de pentasacárido de un enlace a antitrombina III (ATIII), denominado pentasacárido activo, que es la estructura necesaria para el enlace de alta afinidad de la heparina a la ATIII y fundamental para la actividad anticoagulante y antitrombótica de la propia heparina. Este pentasacárido, presente dentro de sólo algunas de las cadenas que forman la heparina, contiene una unidad glucosamina sulfatada en la posición 3 y un ácido glucurónico espaciado entre disacáridos que contienen 35 ácidos idurónicos.

En la naturaleza, la formación del pentasacárido activo se hace posible mediante la reacción de epimerización del carboxilo de una parte de las unidades glucurónicas dentro de las unidades idurónicas llevada a cabo por la glucuronil-C5-epimerasa (epimerización en C5) y mediante la adecuada sulfatación que también conduce a la introducción de un grupo sulfato en el hidroxilo en la posición 3 de la glucosamina. Más particularmente, en la 40 naturaleza la formación del pentasacárido activo se hace posible por el hecho de que la epimerización en C5 se produce en conglomerados, es decir en partes de cadenas, y de manera extensiva, lo que da como resultado un producto que contiene más unidades idurónicas que glucurónicas. La heparina comercial, en realidad, contiene aproximadamente un 70% de unidades idurónicas y un 30% de unidades glucurónicas. Junto a las principales actividades anticoagulantes y antitrombóticas, la heparina también ejerce actividades antilipémicas, antiproliferativas, 45 antivirales, antitumorales y antimetastásicas, pero su uso como un fármaco se ve obstaculizado por los efectos secundarios debido a la acción anticoagulante que puede provocar hemorragia.

TÉCNICA ANTERIOR

Se conoce que el polisacárido K5 capsular aislado de Escherichia coli, descrito por Vann W. F. et al., en European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364 (“Vann 1981”), consiste en una mezcla de cadenas que consisten en la 50 unidad de repetición de disacárido glucuronil--14-N-acetil glucosamina y por tanto muestra la misma secuencia de repetición (A)

del precursor N-acetil-heparosano de la heparina. El polisacárido K5 capsular, denominado en lo sucesivo en el presente documento “polisacárido K5” o más simplemente “K5”, se modificó químicamente por Lormeau et al. tal como se describe en el documento EP 5.550.116 y por Casu et al, tal como se describe en Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284. Se describen K5-O-sulfatos que tienen actividades antitumorales, antimetastásicas, antivirales, 5 en particular anti-VIH en los documentos EP 333243 y WO 98/34958. También se modificó el K5 química y enzimáticamente con el fin de obtener productos que tuvieran el mismo tipo de actividad biológica in vitro en la coagulación como el de heparina tal como se extrae de órganos animales (heparina extractiva).

La obtención de los productos que tienen una actividad en la coagulación del mismo tipo como el de a heparina extractiva se produce mediante procedimientos que imitan lo que ocurre en la naturaleza y prevén la etapa clave 10 completa de epimerización en C5 con D-glucuronil-C5-epimerasa.

Los procedimientos descritos en los documentos IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425 y WO 97/43317 utilizan K5 como material de partida. El K5 originado de la fermentación se somete a N-desacetilación seguido por N-sulfatación y sobre el K5-N-sulfato así obtenido se realiza la epimerización en C5 con C5-epimerasa en disolución, obtenida o bien mediante cromatografía de una disolución de enzimas microsómicas de mastocitoma de ratón 15 (documento IT 1230 785) o bien de hígado bovino (documentos WO 92/17507, WO 96/14425 y WO 97/43317).

La D-glucuronil-C5-epimerasa de hígado bovino se purificó por Campbell, P. et al. en J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958 (“Campbell 1994”) quien también suministró su composición en aminoácidos y describió su uso en disolución para la transformación de un K5-N-sulfato en el correspondiente producto epimerizado el 30%, demostrando la formación de ácido idurónico mediante el método de HPLC seguido por la despolimerización nitrosa 20 total para dar disacárido.

El documento WO 98/48006 describe la secuencia de ADN que codifica para la D-glucuronil-C5-epimerasa y una D-glucuronil-C5-epimerasa recombinante, obtenida a partir de un vector de expresión recombinante que contiene dicho ADN, purificado después por Campbell et al. tal como se muestra por Jin-Ping L. et al. en J. Biol Chem. 2001, 276, 20069-20077 (“Jin-Ping 2001”). 25

La secuencia de la C5-epimerasa completa se describió por Crawford B. E. et al. en J. Biol. Chem., 2001, 276 (24), 21538-21543 (Crawford 2001).

El documento WO 01/72848 describe un método para la preparación de derivados N-desacetilados N-sulfatados de polisacárido K5, al menos epimerizado el 40% de ácido idurónico en cuanto al total de los ácidos urónicos, que tienen un peso molecular de desde 2.000 hasta 30.000, que contienen desde el 25 hasta el 50% de cadenas de alta 30 afinidad para la ATIII y que tienen una actividad anticoagulante y antitrombótica expresada como una razón HClI/antiXa de desde 1,5 hasta 4. Dicho documento describe la sobresulfatación de un K5-N-sulfato, epimerizado el 40-60% y muestra que el producto obtenido, cuyo 13C-RMN se ilustra, tiene un contenido en grupo sulfato por unidad de disacárido de 2-3,5.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de un polisacárido K5 N-desacetilado, N,O-sobresulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60%, que tiene un grado de sulfatación de desde 4 hasta 4,6 (derivado de epiK5-N,O-sobresulfato), caracterizado porque

(a) un polisacárido K5 N-desacetilado, N-sulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60%, (derivado 5 de epiK5-N-sulfato) que tiene un peso molecular medio de desde 1.000 hasta 25.000, en forma ácida, se trata con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando que la mezcla de reacción repose durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos a un pH de 7 y se aísla su sal con dicha base orgánica;

(b) dicha sal de base orgánica de dicho derivado de epiK5-N-sulfato se trata con un reactivo de O-sulfatación en las condiciones de O-sobresulfatación; 10

(c) el polisacárido K5 N-desacetilado, O-sobresulfatado, epimerizado en C5 desde el 20% hasta el 60% (derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato), que tiene un grado de sulfatación de desde 3,55 hasta 3,8 así obtenido se somete a N-sulfatación mediante métodos conocidos y se aísla el derivado de epiK5-N,O-sobresulfato así obtenido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho derivado de epiK5-N,O-sobresulfato se aísla 15 en forma de sal de sodio y se transforma opcionalmente en otra sal química o farmacéuticamente aceptable.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque en la etapa (a) se usa hidróxido de tetrabutilamonio como base orgánica.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en la etapa (b) se lleva a cabo la O-sobresulfatación en dimetilformamida usando 2-4 moles de reactivo de O-sulfatación por OH disponible 20 por disacárido a una temperatura de 40-60ºC durante 15-20 horas.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque un derivado de epiK5-N-sulfato N-sulfatado al 100% se usa como material de partida.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho derivado de epiK5-N-sulfato de partida está epimerizado en C5 el 40-60%. 25

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho derivado de epiK5-N-sulfato de partida tiene un peso molecular medio de desde 1.500 hasta 25.000.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho derivado de epiK5-N-sulfato de partida tiene un peso molecular medio de entre 10.000 y 25.000.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho material de partida 30 tiene un peso molecular medio de desde 1.000 hasta 12.000.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho material de partida tiene un peso molecular medio de desde 1.500 hasta 8.000.

11. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque un derivado de epiK5-N-sulfato se usa como material de partida que consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la 35 fórmula I

en la que las unidades urónicas consisten en un 20-60% de ácido idurónico, n es un número entero desde 2 hasta 100 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho material de partida consiste en una mezcla 40 de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I, en la que las unidades urónicas consisten en un 40-60% de ácido idurónico.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque, en la fórmula I, n representa un número entero desde 3 hasta 100.

14. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho material de partida consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I'

5

en la que las unidades urónicas consisten en un 20-60% de ácido idurónico, q es un número entero desde 2 hasta 20 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho material de partida consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I', en la que q es un número entero desde 3 hasta 15. 10

16. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho material de partida consiste en una mezcla de cadenas en la que la especie preponderante tiene la fórmula I'a

en la que las unidades urónicas consisten en un 60-40% de ácido glucurónico y de un 40% a un 60% de ácido idurónico, p es un número entero desde 4 hasta 8 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente 15 aceptable.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el peso molecular medio de dicho material de partida es de desde 2000 hasta 4000.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque dicho material de partida consiste en una mezcla de cadenas en la que la especie preponderante tiene la fórmula I'b 20

en la que X es hidroxietilo, m es 4, 5 ó 6 y las unidades glucurónicas e idurónicas están presentes de manera alternante, empezando con una unidad glucorónica o idurónica.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 18, caracterizado porque dicho material de partida procede de una N-desacetilación y de una N-sulfatación de un K5 que está libre de sustancias lipófilas. 25

20. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato que puede obtenerse según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según la reivindicación 20, caracterizado porque consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula III

en la que las unidades urónicas consisten en un 20-60% de ácido idurónico, R, R', R'' representan hidrógeno o SO3-, R siendo SO3- en al menos el 40% de dicha mezcla de cadenas, Z es un grupo SO3-, n es un número entero desde 2 hasta 100, el grado de sulfatación es de desde 4 hasta 4,6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable. 5

22. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según la reivindicación 21, en el que dicho catión química o farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en iones de metal alcalino, metales alcalinotérreos, amonio, tetraalquil(C1-C4)amonio, aluminio y zinc.

23. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según la reivindicación 22, en el que dicho catión química o farmacéuticamente aceptable es un ión sodio, calcio o tetrabutilamonio. 10

24. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según la reivindicación 21, que consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula III en la que R es SO3- en el 50%-80% de dichas cadenas, para un grado de sulfatación de desde 4 hasta 4,6.

25. Derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según la reivindicación 21, que consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula III, en la que Z es SO3-, las unidades urónicas consisten 15 en un 40-60% de ácido idurónico, n es un número entero desde 2 hasta 100, con un peso molecular medio de desde 2.000 hasta 45.000, R es en un 50-80% SO3-, R' y R'' son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es en un 5-10% SO3- en ácido glucurónico monosulfatado y en un 10-15% SO3- en ácido idurónico monosulfatado, para un grado de sulfatación de desde 4 hasta 4,6 y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.

26. Derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato cuyo contenido en ácido idurónico es del 20-60% del total de los ácidos 20 urónicos, que tiene un grado de sulfatación de desde 3,55 hasta 3,8, que puede obtenerse según las etapas (a) y (b) de la reivindicación 1, aislado en forma de sal de sodio y, opcionalmente, transformada en otra sal química o farmacéuticamente aceptable.

27. Derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato según la reivindicación 26, caracterizado porque dicho derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato consiste en una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de dichas cadenas 25 tienen la fórmula II

en la que las unidades urónicas consisten en un 20-60% de ácido idurónico, n es un número entero desde 2 hasta 100, R, R' y R'' son hidrógeno o SO3- y el catión correspondiente es química o farmacéuticamente aceptable.

28. Derivado de epiK5-amina-O-sobresulfato según la reivindicación 27, que consiste en una mezcla de cadenas en 30 la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula II en la que las unidades urónicas consisten en un 40-60% de ácido idurónico, R es en un 50-80% SO3-, R' y R'' son ambos SO3- o uno es hidrógeno y el otro es en un 5-14% SO3- en ácido glucurónico monosulfatado y en un 10-15% SO3- en ácido idurónico monosulfatado.

29. Composición farmacéutica que incluye, como uno de sus principios activos, una cantidad farmacológicamente activa de un derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según una cualquiera de las reivindicaciones de 20 a 25 en mezcla 35 con un excipiente farmacéutico.

30. Composición cosmética que incluye una cantidad eficaz de un derivado de epiK5-N,O-sobresulfato según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en mezcla con un excipiente cosmético.