Método de genotipado.

Un método para genotipar diferentes secuencias diana en la misma muestra,

que comprende

i) construir cebadores de genotipado, en el que los cebadores comprenden una secuencia específica del gen ligada a una secuencia ID que se asigna a cada genotipo, en el que cada secuencia ID consiste en una marca ID que es un nucleótido seleccionado entre A, T, C y G, N indicadores (S) que son nucleótidos dispuestos en el mismo orden y diferentes de la marca ID adyacente, una marca final (E) que es un nucleótido que sigue y es diferente del indicador más posterior; en el que N es un número natural que oscila de 2 a 32 y en el que la marca ID se puede situar delante del indicador y puede ser uno de tres nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente del indicador situado detrás de él, o la marca o marcas ID pueden estar situadas entre dos indicadores y pueden ser uno de dos nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente de los indicadores situados a ambos lados de él;

ii) amplificar moldes de los genes diana mediante PCR usando los cebadores de genotipado de i), obteniendo de ese modo productos de PCR; y

iii) secuenciar los productos de PCR de la etapa ii) con distribución de dNTPs según el orden de las secuencias ID diseñado en la etapa i), orden en el cual el dNTP para la marca final no está incluido;

iv) genotipar según el nucleótido y situación de la marca ID.

Método de genotipado

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método de genotipado múltiple que usa una secuencia ID, que se asigna a cada genotipo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Los métodos que se han desarrollado para detectar organismos infecciosos incluyen métodos tradicionales de identificación de las características físicas y químicas de patógenos mediante cultivo, y métodos de detección de las características genéticas específicas de los patógenos. Los métodos para detectar características genéticas incluyen análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , análisis de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) , electroforesis en gel de campo pulsado, reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR) , PCR a base de secuencia repetitiva, ribotipado, y secuenciación de ácido nucleico comparativa. Estos métodos son generalmente demasiado lentos, caros, irreproducibles, y técnicamente exigentes para ser usados en la mayoría de los escenarios de diagnóstico. Todos los métodos mencionados anteriormente requieren generalmente que se use una etapa electroforética en gel engorrosa, que el patógeno se haga crecer en cultivo, que se purifique su ADN genómico, y que la muestra no contenga más de un tipo de organismo. Estas limitaciones también se aplican a métodos de detección desarrollados recientemente que emplean micromatrices de alta densidad (Salazar et al., Nucleic Acids Res. 24:5056-5057, 1996; Troesch et al., J. Clin. Microbiol. 37:49-55, 1999; Lashkari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13057-13062, 1997) . Mientras, la pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN basado en el principio de "secuenciación mediante síntesis de ADN", que se basa en la detección de la liberación de pirofosfato en la incorporación nucleotídica, a diferencia del método tradicional de secuenciación de Sanger. En el método de pirosecuenciación, se añaden secuencialmente cuatro trifosfatos desoxinucleotídicos (dNTPs) uno a uno durante la polimerización. El PPi unido a los dNTPs que se polimerizan emite luz mediante reacciones enzimáticas, y la luz emitida muestra un pico de señal según el orden de reacción de cada uno de los dNTPs añadidos secuencialmente, en el que el pico muestra un patrón que es alto o bajo en proporción al número de los dNTPs que se hicieron reaccionar, de manera que se puede determinar la secuencia nucleotídica del patógeno. En años recientes, se han usado métodos para detectar bacterias o virus patógenos en muestras clínicas basados en pirogramas obtenidos mediante pirosecuenciación de los productos de PCR de secuencias específicas de los patógenos (Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007) .

Sin embargo, en la técnica de pirosecuenciación, la secuencia nucleotídica se lleva a cabo según el orden de distribución de dNTPs, y un nucleótido en el molde, que está ausente en el orden de distribución, no reacciona, y de este modo no forma un pico. Sin embargo, cuando aparecen continuamente nucleótidos idénticos en el orden de distribución, las alturas de los picos se determinan según las intensidades de luz emitida. En consecuencia, cuando existen diversos patógenos en la misma muestra, los picos de los nucleótidos de los diversos patógenos aparecen solapados, haciendo así difícil identificar los genotipos a través de la interpretación de los pirogramas. Particularmente, a medida que aumenta el número de secuencias repetitivas, los picos de las secuencias anteriores se hacen relativamente más bajos. De este modo, en el caso de infección con múltiples patógenos, es difícil detectar un pico según el grado de infección con cada patógeno.

En consecuencia, los presentes inventores han realizado esfuerzos exhaustivos para permitir identificar los genotipos de interés mediante programas únicos y simples obtenidos cuando se lleva a cabo el genotipado usando pirosecuenciación. Como resultado, se ha encontrado que, cuando una secuencia ID, que tiene una marca ID, un indicador y una marca final, mientras que existe independientemente de la secuencia específica a tipar, está ligada con la secuencia específica y se usa para llevar a cabo la pirosecuenciación, se puede obtener un programa único y simple para cada genotipo, completando de ese modo la presente invención.

El documento WO 2008/061193 describe la secuenciación multietiqueta y análisis ecogenómico.

El documento WO 2009/049889 describe un método de genotipado de HLA de alta resolución y alto rendimiento mediante secuenciación clonal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método de genotipado que usa una secuencia ID que es útil para llevar a cabo la pirosecuenciación a fin de permitir identificar los genotipos de interés mediante programas únicos y simples.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para genotipar HPV usando dicha secuencia ID.

Se describe además un método para detectar la mutación del gen KRAS usando dicha secuencia ID.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para detectar virus respiratorio usando dicha secuencia ID.

Se describe una secuencia ID para el genotipado que consiste en A (ID-S) n-E, en la que ID es una marca ID que es un solo nucleótido seleccionado de entre A, T, C y G; S es un indicador, que es un nucleótido enlazado con la marca ID adyacente y diferente del de la marca ID adyacente; E es una marca final, que es un nucleótido diferente de aquél del indicador; y n es un número natural que oscila de 1 a 32.

También se describe una secuencia ID para el genotipado que consiste en ID-S, en la que ID es una marca ID que es un nucleótido seleccionado de entre A, T, C y G, y S es un indicador que es un nucleótido enlazado con la marca ID adyacente y diferente de aquél de la marca ID adyacente.

Se describe también un cebador de genotipado que comprende una secuencia específica del gen para el genotipado ligada a dicha secuencia ID.

La presente invención proporciona un método para genotipar diferentes secuencias diana en la misma muestra, que comprende i) construir cebadores de genotipado, en el que los cebadores comprenden una secuencia específica del gen ligada a una secuencia ID que se asigna a cada genotipo, en el que cada secuencia ID consiste en una marca ID que es un nucleótido seleccionado entre A, T, C y G, N indicadores (S) que son nucleótidos dispuestos en el mismo orden y diferentes de la marca ID adyacente, una marca final (E) que es un nucleótido que sigue y es diferente del indicador más posterior; en el que N es un número natural que oscila de 2 a 32 y en el que la marca ID se puede situar delante del indicador y puede ser uno de tres nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente del indicador situado detrás de él, o la marca o marcas ID pueden estar situadas entre dos indicadores y pueden ser uno de dos nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente de los indicadores situados a ambos lados de él;

ii) amplificar moldes de los genes diana mediante PCR usando los cebadores de genotipado de i) , obteniendo de ese modo productos de PCR; y iii) secuenciar los productos de PCR de la etapa ii) con distribución de dNTPs según el orden de las secuencias ID diseñado en la etapa i) , orden en el cual el dNTP para la marca final no está incluido;

iv) genotipar según el nucleótido y situación de la marca ID.

La presente invención también proporciona un método para genotipar HPV según el método anterior, en el que la secuencia específica del gen se selecciona entre secuencias nucleotídicas de SEC ID NOs: 1 a 15.

Se describe un método para detectar mutación del gen KRAS, comprendiendo el método las etapas de: (a) diseñar una secuencia ID para genotipado según la mutación génica de cada KRAS, consistiendo la secuencia ID en (ID-S) n-E, en el que ID es una marca ID que es un nucleótido seleccionado entre A, T, C y G; S es un indicador que es un nucleótido ligado con la marca ID adyacente y diferente del de la marca ID adyacente; E es una marca final que es un nucleótido diferente de aquel del indicador, y n es un número natural que oscila de 1 a 32; (b) construir un cebador de detección compuesto de una secuencia de cebador de pirosecuenciación, la secuencia ID, y una secuencia específica para una mutación del gen KRAS que corresponde a la secuencia ID; (c) amplificar una muestra que contiene el gen KRAS mediante PCR usando el cebador de detección; y (d) someter... [Seguir leyendo]

1. Un método para genotipar diferentes secuencias diana en la misma muestra, que comprende i) construir cebadores de genotipado, en el que los cebadores comprenden una secuencia específica del gen ligada a una secuencia ID que se asigna a cada genotipo, en el que cada secuencia ID consiste en una 5 marca ID que es un nucleótido seleccionado entre A, T, C y G, N indicadores (S) que son nucleótidos dispuestos en el mismo orden y diferentes de la marca ID adyacente, una marca final (E) que es un nucleótido que sigue y es diferente del indicador más posterior; en el que N es un número natural que oscila de 2 a 32 y en el que la marca ID se puede situar delante del indicador y puede ser uno de tres nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente del indicador situado detrás de él, o la marca o marcas ID

pueden estar situadas entre dos indicadores y pueden ser uno de dos nucleótidos diferentes que consiste en un nucleótido diferente de los indicadores situados a ambos lados de él;

ii) amplificar moldes de los genes diana mediante PCR usando los cebadores de genotipado de i) , obteniendo de ese modo productos de PCR; y iii) secuenciar los productos de PCR de la etapa ii) con distribución de dNTPs según el orden de las 15 secuencias ID diseñado en la etapa i) , orden en el cual el dNTP para la marca final no está incluido;

iv) genotipar según el nucleótido y situación de la marca ID.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los genes diana se seleccionan del grupo de genes virales, genes de enfermedades, genes bacterianos, y genes de identificación.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la diana es HPV, y en el que la secuencia específica de un gen se 20 selecciona entre las secuencias nucleotídicas de SEC ID NOs:1 a 15.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la diana es un virus respiratorio, y en el que la secuencia específica de un gen es SEC ID NO:41 para el virus de la gripe A, SEC ID NO:42 para el virus de la gripe B, SEC ID NO:43 para RSV B, SEC ID NO:44 para rinovirus, y SEC ID NO:45 para coronavirus OC43.