CONSTRUCCIÓN DE UNA UNIDAD DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS DE 60-200 NUCLEÓTIDOS EN TAMAÑO.
Construcción de una unidad de resistencia a antibióticos de 60-200 nucleótidos en tamaño.
La eficiencia de elementos transponibles en mutagénesis se ve limitada, entre otras causas, por su capacidad de incorporar información marcadora. Este aspecto ha resultado ser crítico en las tecnologías de mutagénesis derivadas del uso de intrones del grupo II. La construcción está constituida por una región con actividad promotora, un espaciador, una región óptima de unión al ribosoma, así como 18 nts que codifican un péptido que confiere una resistencia a antibióticos derivados de macrólidos. Todo ello supone en su conjunto un fragmento de ADN entre 60 y 200 nts que proporciona resistencia a un antibiótico y por tanto permite su aplicación como marcador selectivo en herramientas mutagénicas como son los intrones del grupo II, o en cualquier unidad de ADN que lo contenga.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130782.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: TORO GARCIA,NICOLAS, MARTINEZ-ABARCA PASTOR,FRANCISCO, NISA MARTÍNEZ,Rafael.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K7/06 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 5 a 11 aminoácidos.
PDF original: ES-2391646_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
CONSTRUCCIÓN DE UNA UNIDAD DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS DE 60-200 NUCLEÓTIDOS EN TAMAÑO.
La construcción motivo de la siguiente invención supone hasta ahora minimizar la longitud de un gen marcador de resistencia hasta unos 60-200 nucleótidos. Este minigén de resistencia permitiría mejorar el uso en mutagénesis de aquellos elementos transponibles que tienen limitada la capacidad de incorporar información y, por tanto, incrementarían de esta manera su eficiencia en movilidad. Este tipo de eficiencia ha resultado ser crítica, en concreto, en tecnologías derivadas del uso de intrones del grupo 11. Con este marcador se supera la limitación actual de este tipo de herramientas de mutagénesis al reducir en más de un 60% el tamaño mínimo utilizado hasta ahora en este tipo de marcadores.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer producen el primer organismo recombinante modificando partes de su ADN, en lo que se considera el comienzo de la ingeniería genética. Ésta se define como la formación in vitro de nuevas combinaciones de material genético mediante la inserción de un ADN de interés en un vehículo genético (vector) , de modo que tras su introducción en un organismo (generalmente Escherichia coli) el ADN híbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.
La ingeniería genética se desarrolló de manera exponencial durante los siguientes años incrementando y diversificando el uso de vectores replicativos acompañados de marcadores de resistencia. Desde entonces, han tenido lugar multitud de variaciones que han permitido su desarrollo para distintos usos. A su vez, el número de marcadores de resistencia (generalmente del tamaño de 1 kb) ha sido también amplio y ha desembocado en un uso frecuente en laboratorios para muy diversos fines. Entre otros, la facilidad y el método selectivo derivado de su uso los ha hecho muy adecuados para su aplicación en vectores y sistemas de mutagénesis desarrollados a partir de transposones y sistemas de recombinación homóloga.
Alternativamente a estos métodos de mutagénesis se han venido desarrollando desde hace 5 años métodos de mutagénesis dirigida basados fundamentalmente en dos intrones bacterianos del grupo 11: uno desarrollado en intrones que de
forma natural no contienen un dominio endonucleasa ejemplificado en Rmlnt1 (Patente PCT: ES-2001 00170/PCT ES02/00030; García-Rodríguez et al. 2011) y otro derivado de intrones que, de forma natural, sí contienen este dominio endonucleasa ejemplificado en Ll.ltrB.
Tabla 1: Efecto del tamaño de inserto en el dominio IV en la eficiencia de invasión 10 de intrones del grupo 11.
Vector Inserción en diV (en nt) Mob. Fr. (%) b lntron invasión Ref. pAC03 (wt) 942:_2% NO (1) pAC03-RAM Tm 313 18.8% NO (2) LI.LtrB donor (wt) 34.4 LI.LtrB donor pHw+ 64 13.2 (38.4) LI.LtrB donor pHw- 64 12.0 (34.9) LI.LtrB donor pHs+ 79 24.0 (69.8) LI.LtrB donor pHs- 79 1.6 (4.7) (3) LI.LtrB donor holin/lysin+ 1180 0.3 (0.9) LI.LtrB donor 1244 NO pHw/holin/lysin- LI.LtrB donor NaCI- 1251 NO LI.LtrB donor 1269 0.4 (1.2) pHs/holin/lysine- LI.LtrB donor pHs/acmA+ 1469 NO Rmlnt1 donor 100 85.4.:!:_3.5 (4) pKGEMA4 (wt) d Rmlnt1 donor pKGEMA4 31 100 63.3.:!:_16.1 (5) T7 (74.1)a Fenotipo de resistencia: (-) no resistente (Tm) resistente a Trimetroprima. b Frecuencia de células en las que al menos ha habido un evento de salto. e Porcentaje de invasión de la diana. Entre paréntesis el valor respecto al vector de referencia sin inserto.
d Vectores de referencia en cada ensayo de movilidad
NO: sin determinar.
De este último ya existe un producto comercial de la firma SIGMA-Aidrich sustentado en 4 patentes internacionales: U .S. Patent Nos. 5, 698, 421, 5, 804, 418, 6, 027, 895 and 6, 001, 608 (Targetrón: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/targetron.html; Chen, et al. 2007) . Estos métodos están suponiendo una alternativa a los distintos métodos "clásicos" de generación de mutantes basados en transposones portadores de una unidad de resistencia. La ventaja añadida viene porque permite rediseñarlos para dirigirlos al sitio a mutagenizar y por su independencia de recombinación homóloga.
Los intrones del grupo 11 desarrollados para la mutagénesis contienen secuencias heterólogas insertadas en el dominio IV del intrón y pueden por tanto ser vehículos potenciales de introducción de un determinado transgén (Nisa-Martínez et al. 2007, Chen, et al., 2007) . Sin embargo, estudios recientes demuestran que la movilidad de estos elementos se reduce severamente (hasta en 4 órdenes de magnitud; Tabla 1) por inserciones de alrededor de 1 Kb (Plante, & Cousineau 2006, Heap, et al., 2007) . Como elementos de mutagénesis dirigida, la incorporación, en los intrones, de marcadores de resistencia que contribuyan a facilitar la selección de los mutantes constituye uno de los aspectos pendientes por desarrollar en esta tecnología. Hasta ahora la unidad más pequeña incorpora un gen de resistencia al antibiótico Trimetroprima, modificado hasta una longitud de 313 nt, reduciéndose la movilidad del intrón a un 20% sobre el silvestre (Tabla 1; Zhong, .et al. 2003) . Por tanto, la búsqueda de unidades de resistencia de un tamaño menor, constituye un paso crítico y supone una importante limitación actual en el desarrollo de estas herramientas de mutagénesis. En este sentido, Tenson y Mankin determinaron a finales de los 90, que la traducción de pequeños péptidos podía generar una resistencia adquirida del ribosoma a antibióticos macrólidos del tipo Er y tromicina (Tenson et al., 1997) . Estos péptidos actúan en cis, esto es, sobre el ribosoma que los está traduciendo; siendo crítico para generar la resistencia tanto la secuencia, como el tamaño (Tenson & Mankin, 2001 ) . La interacción sobre el ribosoma de estos péptidos parece ser similar a la de los macrólidos del tipo Er y tromicina (Tenson & Mankin, 2001 ) ..
El uso de estos minigenes (péptidos de 5 aminoácidos) en el contexto adecuado,
p. ej. en los sistemas de mutagénesis basados en los intrones del grupo 11, puede generar herramientas útiles de resistencia donde el tamaño de éstas sea crítico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El objeto de la siguiente invención consiste en la construcción de una molécula de ácido nucleico que contenga una unidad mínima de resistencia a antibióticos que comprende los siguientes pasos:
a) Aportar una secuencia mínima de 18 nucleótidos (minigén) que codifica para un péptido que confiere resistencia a antibióticos o drogas derivadas de macrólidos que comprende pero sin limitarse a Er y tromicina, Oleandomicina y Espira m icina .. b) Unirla a una secuencia rica en purinas (A, G) correspondiente al sitio de unión al ribosoma que permita una traducción eficiente del péptido mencionado y e) Unirla a una secuencia promotora que permita la transcripción del minigén descrito.
Todo ello da lugar a una secuencia mínima de unos 60-200 nucleótidos con capacidad de resistencia que pueda ser empleada en cualquier aplicación in vivo
o in vitro y, en particular, en sistemas de mutagénesis o control de la expresión génica derivados del uso de los intrones del grupo 11.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La construcción de una unidad mínima de resistencia a antibióticos, se basa en un fragmento aislado de ADN, que contiene una secuencia de 18 nucleótidos que codifica un péptido de 5 aminoácidos (ATG NNN NNN NNN NNN TGNTANTAG) , también denominado "minigén". Estudios previos muestran que cualquier mutación que produzca un cambio en el codón de parada elimina la resistencia. Adicionalmente, esta secuencia debe de codificar una Leucina ó lsoleucina en su posición tercera así como un aminoácido hidrofóbico en el último codón, generalmente Valina aunque también puede utilizarse Treonina o lsoleucina (Tenson, et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 5641-5646) .
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Reivindicaciones:
1. Una molécula de ácido nucleico caracterizada por tener al meno.
6. 200 nucleótidos y por comprender:
a) al menos una secuencia codificante de al menos 18 nucleótidos que codifica un péptido con resistencia a drogas derivadas de macrólidos, dicho péptido presenta la siguiente fórmula:
a1 -a2 -a3 -a4 -as donde a1 es Met, a2 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales, a3es Leu o
1 O lso, a4 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales y as se selecciona entre Val, Thr ó lle, b) al menos un sitio de unión al ribosoma (RBS) : secuencia rica en purinas que situada a una distancia entre 6-9 nucleótidos del codón de iniciación (ATG) del péptido citado en a) , permite su traducción y
e) al menos una secuencia promotora reconocida por una RNA polimerasa.
2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia codificante de al menos 18 nucleótidos que codifica un péptido con resistencia a drogas derivadas de macrólidos citada en a) codifica
un péptido con secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 13.
3. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizada por comprender: d) al menos una secuencia promotora inducible o constitutiva dependiente
de la RNA polimerasa de la célula hospedadora, que comprende: pSyn, pTacl, pTacll, pTrp, tic, trc, RecA, y pl.
4. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 caracterizada porque la secuencia promotora citada en
e) es reconocida por una RNA polimerasa de un fago que comprende a: T7, T3, ySP6.
5. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 caracterizada porque la secuencia codificante de al
menos 18 nucleótidos que codifica un péptido con resistencia a drogas derivadas de macrólidos citada en a) está total o parcialmente modificada mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones o inserciones.
6. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5 caracterizada porque el sitio de unión al ribosoma (RBS) citado en b) y su distancia al codón de iniciación están total o parcialmente modificadas mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones o inserciones.
7. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 caracterizada porque la secuencia promotora citada en e) es total o parcialmente modificada mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones o inserciones.
8. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1
o 7 caracterizada porque la secuencia codificante de al menos 18 nucleótidos que codifica un péptido con resistencia a drogas derivadas de macrólidos citada en a) , el sitio de unión al ribosoma (RBS) citado en b) y la secuencia promotora citada en e) están total o parcialmente modificadas mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones o inserciones.
9. Uso de la molécula de ácido nucleico definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 en un proceso de mutagénesis que incluya tecnología derivada de transposones ó tecnología derivada de lntrones del grupo 11.
1O. Uso de la molécula de ácido nucleico definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 para la obtención de un Vector de Clonación.
11. Uso de la molécula de ácido nucleico definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 en el etiquetado de un fragmento de ADN mediante la Amplificación en Cadena de la Polimerasa (PCR) .
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