Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y diferenciación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp y Mycobacterium tuberculosis complex.

La presente invención se refiere al diseño de un conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit de diagnóstico molecular para diferenciar entre Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex; más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella y del genero Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas no sanguíneas, que está basada en la amplificación simultánea de ADN de ambos géneros mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple en Tiempo Real. La técnica desarrollada ha mostrado ser mucho más sensible que los métodos bacteriológicos, y más específica que los métodos serológicos habituales, permitiendo su utilización la puesta en práctica de un procedimiento fácil y rápido de diagnóstico molecular diferencial entre tuberculosis extrapulmonar y complicaciones focales producida por Brucella spp. en muestras clínicas

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y diferenciación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp y Mycobacterium tuberculosis complex.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit de diagnóstico molecular para diferenciar entre Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex; más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella y del genero Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas no sanguíneas, que está basada en la amplificación simultánea de ADN de ambos géneros mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple en Tiempo Real (M-RT-PCR).

Estado de la técnica

La tuberculosis y la brucelosis son enfermedades que producen una alta morbilidad y continúan siendo un importante problema socio-sanitario en nuestro medio. La tuberculosis sigue siendo la infección más prevalente del planeta. Se estima que 2.000 millones de personas están infectadas por Mycobacterium tuberculosis. Este enorme reservorio genera unos 8 millones de nuevos casos de tuberculosis al año y 2 millones de muertes directamente atribuibles a la enfermedad (Castro KG., 1998, Emerg Infect Dis., 4: 408-9). La prevalencia de infección tuberculosa en nuestro país oscila entorno al 30-35% de la población, y la incidencia de enfermedad tuberculosa es de 37 casos/100.000 habitantes (Work Group of the MPTR. 2000, Med. Clin. (Barc) 114: 530-7). Las localizaciones extrapulmonares suponen entre el 20 y el 40% del total de casos de tuberculosis (Denis-Delpierre N y cols., 1998, Presse Med., 27: 341-346). Las localizaciones genitourinaria, meníngea y osteoarticular totalizan más del 50% de las formas extrapulmonares de la tuberculosis (Alvarez S. McCabe WR. 1984, Medicine (Baltimore), 63: 25-55). Dentro de la localización osteoarticular, la osteomielitis vertebral supone más del 45% de los casos (Davies PD y cols., 1984, Bone Joint Surg 66: 326-330).

El diagnóstico de las formas extrapulmonares de la tuberculosis puede ser: directo, mediante el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis en distintas muestras clínicas, o indirecto mediante la demostración de granulomas caseificantes en material histológico o detección de la presencia de BAAR, en el contexto de cuadro clínico compatible. El aislamiento del germen es la única prueba categórica de enfermedad tuberculosa. Sin embargo, la rentabilidad de los cultivos de micobacterias en las diferentes formas extrapulmonares de la tuberculosis es bajo, no superando el 70%. Por otra parte, excepto las tinciones en fluidos de cavidades estériles, todos los métodos convencionales de diagnóstico de la tuberculosis son lentos, oscilando entre 3 y 5 días en el caso de los métodos histológicos, a semanas en el caso de los cultivos de micobacterias (Pertuiset E y cols., 1999, Medicine (Baltimore), 78: 309-20).

La brucelosis es la zoonosis más extendida en el planeta, siendo endémica en la mayoría de los países de la cuenca Mediterránea, Oriente medio, África, Subcontimente Asiático y Latino-americano. A pesar del descenso de la enfermedad en los últimos años, la incidencia de brucelosis en España supera ampliamente la media de los países de nuestro entorno, y se estima que más de la mitad del territorio nacional padece unas tasas de incidencia superiores a 5 casos/100.000 habitantes, lo cual multiplica por 7 las cifras medias de los países de la Unión Europea. Sin embargo, esta incidencia infraestima de forma muy notable la magnitud del problema ya que la infradeclaración es un hecho bien conocido. Según opinión de expertos habría que multiplicar entre 3 y 5 veces las cifras oficialmente comunicadas para acercarse a la cifra real de casos. En 2003 se declararon en España 642 nuevos casos de brucelosis, lo que representa una incidencia de 1,6 casos/100.000 habitantes. Sin embargo la incidencia varía ampliamente de unas Comunidades y regiones a otras. Así, la incidencia en la Comunidad Autónoma de Andalucía es superior a la media nacional y dentro de nuestra Comunidad Autónoma, Málaga es una de las provincias más afectadas ya que su incidencia es muy superior a la media de la Comunidad Autónoma (Anónimo. 2004, Boletín Epidemiológico Semanal. Ministerio de Sanidad y Consumo. Centro Nacional de Epidemiología. España, Vol 12, nº 10).

La brucelosis se transmite por dos mecanismos claramente definidos: contagio directo, mediante contacto, inoculación o inhalación, o por vía indirecta, a través de la ingestión de productos lácteos sin higienizar. El contacto con materiales infectados (abortos, placentas, estiércol, etc.) es probablemente el mecanismo principal en profesionales expuestos. Sin embargo, la ingestión de leche o productos lácteos no higienizados de procedencia casera supone todavía un mecanismo importante de contagio en amplias áreas de nuestro país. Por otra parte, como el periodo de incubación es muy variable, oscilando entre dos semanas y varios meses, la enfermedad puede manifestarse lejos del lugar en el que fue adquirida.

El espectro clínico de la brucelosis es sumamente inespecífico y heterogéneo. Habitualmente la enfermedad se manifiesta como un síndrome febril sin foco aparente, si bien entre el 25 y el 35% de los casos presentarán una o más formas focales a lo largo del curso evolutivo de la enfermedad. Dentro de las formas focales de las brucelosis, las referidas al aparato locomotor son las más frecuentes, y las neurológicas junto con las cardiovasculares, las más graves. Por su curso más prolongado y su peor pronóstico las formas focales se consideran verdaderas complicaciones de la enfermedad (Colmenero, J. D. y cols., 1996 Medicine (Baltimore), 75: 195-211). Además del coste humano, la brucelosis en general y sus complicaciones en particular, generan elevadísimas pérdidas económicas consecuencia del gasto sanitario y de la reducción de la capacidad laboral del paciente por largos periodos de tiempo (Colmenero JD y cols., 1989, Rev Clin Esp, 185: 459-63).

El patrón oro ("gold standard") en el diagnóstico de la brucelosis es el aislamiento del germen, generalmente mediante la realización de hemocultivos. Sin embargo, el rendimiento del hemocultivo en las complicaciones focales no supera del 40 al 50%, y desciende aún más en las muestras no sanguíneas donde raramente supera el 40% (Colmenero, J. D. y cols., 1996 Medicine (Baltimore), 75: 195-211; Ariza, J, y cols., 1995 Clin Infect Dis.; 20: 1241-9). Por otra parte, aún con la tecnología más avanzada, Brucella spp. es un germen exigente que requiere generalmente incubaciones prolongadas, suponiendo además un alto riesgo de infección para el personal de laboratorio que manipula microorganismos vivos (Yagupsky P, y cols., 2000, Scand J Infect Dis.; 32: 31-5). Por ello, el diagnóstico de la brucelosis habitualmente se basa en la demostración de anticuerpos específicos frente a diversos antígenos más o menos específicos del género Brucella mediante diferentes pruebas serológicas (Young, E.J. 1991, Rev Infect Dis., 13: 359-72). En general, las pruebas serológicas son fáciles de realizar pero su especificidad se reduce notablemente en zonas de alta endemia, en la población profesionalmente expuesta, en los pacientes que han padecido la infección recientemente y en las relativamente frecuentes recidivas de la enfermedad (Ariza, J., y cols., Clin Infect Dis. 14: 131-40; Pellicer T, y cols., 1988, J Infect Dis; 157:918-24).

Tanto la tuberculosis como la brucelosis son infecciones sistémicas capaces de producir afectación de prácticamente todos los órganos y aparatos. Existen diferentes cuadros clínicos como la meningitis linfocitaria, osteomielitis vertebral y orquiepididimitis subagudas, en las cuales el diagnóstico diferencial siempre debe incluir tanto la brucelosis como la tuberculosis, etiologías imposibles de diferenciar entre sí en base a datos exclusivamente clínicos (Colmenero JD, y cols., 1997, Ann Rheum Dis. 56: 709-15).

El diagnóstico etiológico precoz de ambas infecciones es fundamental para su adecuado tratamiento y reducción de la morbilidad asociada a la demora diagnóstica. Por otra parte, un diagnóstico más preciso evitaría el uso de tratamiento tuberculostático y antibrucelar empíricos, tan frecuentes en la práctica clínica y no exentos de riesgos innecesarios para los pacientes.

Para obviar en la medida de lo posible las limitaciones de los métodos diagnósticos convencionales en la brucelosis humana, nuestro grupo ha desarrollado en los últimos años... [Seguir leyendo]

1. Conjunto de cebadores para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas, caracterizado porque al menos cuatro de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4.

2. Conjunto de cebadores para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1, por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2, un tercer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3 y un cuarto cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 4.

3. Conjunto de cebadores para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1, la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2, la secuencia de nucleótidos del tercer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 3 y la secuencia de nucleótidos del cuarto cebador es idéntica a la SEQ ID NO 4.

4. Sondas de hibridación para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas, caracterizadas porque presentan una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8.

5. Sondas para la para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas según la reivindicación 4, caracterizada porque presenta unas secuencias de nucleótidos idénticas a la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8.

6. Sondas para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque dichas sondas SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 7 se marcan con fluorescina-6-carboxi en el extremo 3' y SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 8 se marcan en el extremo 5' con el fluoróforo LightCycler Red 640 y fluoróforo LightCycler Red 705 respectivamente.

7. Procedimiento para la detección e identificación de ADN específico de Brucella spp. y Mycobacterium tuberculosis complex en muestras clínicas caracterizado porque incluye las siguientes etapas: