Compuestos poliméricos con propiedades inmovilizantes.

La presente invención se refiere a compuestos poliméricos con propiedades inmovilizantes sobre biomoléculas.

Dichos materiales comprenden un núcleo de nanopartículas híbridas súper-paramagnéticas y grupos vinilsulfona para llevar a cabo la inmovilización de las biomoléculas. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de dichos compuestos poliméricos.

Compuestos poliméricos con propiedades inmovilizantes.

La presente invención se refiere a compuestos poliméricos con propiedades inmovilizantes sobre biomoléculas. Dichos materiales comprenden un núcleo de nanopartículas híbridas súper-paramagnéticas y grupos vinilsulfona para llevar a cabo la inmovilización de las biomoléculas. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de dichos compuestos poliméricos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las nano-partículas súper-magnéticas están generalmente compuestas por elementos magnéticos, tales como, hierro, níquel, cobalto y sus óxidos. Las nanopartículas magnéticas más conocidas son óxidos de hierro, magnetita (Fe3O4) , magemita (D-Fe2O3) u otras ferritas, que son insolubles en agua. Nano-partículas magnéticas sin agentes de recubrimiento de su superficie poseen una superficie hidrofóbica con alta superficie específica y una elevada tendencia a aglomerarse. El adecuado recubrimiento de la superficie de las nano-partículas magnéticas permite que se puedan dispersar y formar ferrofluidos homogéneos y aumentar su estabilidad. Diferentes materiales se han empleado para recubrir la superficie de nanopartículas magnéticas: (a) polímeros orgánicos, tales como, dextrano, quitosano, polietilenglicol, etc, (b) surfactantes orgánicos, tales como, oleato sódico, dodecilamina, (c) metales inorgánicos, tales como, oro, (d) óxidos inorgánicos, tal como sílice, (e) moléculas bioactivas, tales como, liposomas, péptidos y ligandos. Las nano-partículas magnéticas recubiertas de un polímero orgánico constituyen un material macromolecular avanzado que posee las propiedades de ambos materiales: el uso de un material inorgánico magnético le confiere a las nanopartículas poliméricas propiedades súper-paramagnéticas que permiten su rápida separación del medio de reacción mediante el uso de un campo magnético, el polímero orgánico permite su dispersión y aumenta su estabilidad.

En los últimos años ha habido un gran interés en el diseño y fabricación de partículas híbridas magnéticas. Estas partículas, por regla general, tienen una estructura de tipo “core-shell” donde el corazón (core) consiste en una o varias nanopartículas magnéticas, mientras que la cubierta (shell) es un polímero entrecruzado.

A este tipo de nanopartículas se les ha dado muy diversas aplicaciones que van desde sistemas de almacenaje de información, desarrollo de dispositivos electrónicos o de interferencia electromagnética (EMI) , hasta sistemas de diagnóstico médico, biosensores ópticos (Svitel, J.; Surugiu, I.; Dzgoev, A.; Ramanathan, K.; Danielsson, B., Functionalized surfaces for optical biosensors: Applications to in vitro pesticide residual analysis. Journal of Materials Science-Materials in Medicine 2001, 12, (10-12) , 1075-1078) y liberación controlada de fármacos (Berr y , C. C.; Curtis, A. S. G., Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. Journal of Physics D-Applied Physics 2003, 36, (13) , R198-R206; Cheng, H.; Kastrup, C. J.; Ramanathan, R.; Siegwart, D. J.; Ma, M. L.; Bogatyrev, S. R.; Xu, Q. B.; Whitehead, K. A.; Langer, R.; Anderson, D. G., Nanoparticulate Cellular Patches for Cell-Mediated Tumoritropic Deliver y . Acs Nano 2010, 4, (2) , 625-631) Además, también se están empezando a usar en la toma de imágenes de resonancia magnética debido al alto contraste que ofrecen y en nuevos tratamientos terapéuticos contra el cáncer mediante el aumento térmico de estas nanopartículas cuando son expuestas a campos magnéticos fuertes (Ji, X. J.; Shao, R. P.; Elliott, A. M.; Stafford, R. J.; Esparza-Coss, E.; Bankson, J. A.; Liang, G.; Luo, Z. P.; Park, K.; Markert, J. T.; Li, C., Bifunctional gold nanoshells with a superparamagnetic iron oxide-silica core suitable for both MR imaging and photothermal therapy. Journal of Physical Chemistr y C 2007, 111, (17) , 6245-6251; Kim, D. H.; Nikles, D. E.; Johnson, D. T.; Brazel, C. S., Heat generation of aqueously dispersed CoFe2O4 nanoparticles as heating agents for magnetically activated drug deliver y and hyperthermia. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2008, 320, (19) , 2390-2396) .

Actualmente, se están haciendo grandes esfuerzos en la funcionalización química y/o bioquímica de las superficies de estas nanopartículas híbridas súper-paramagnéticas (“super paramagnetic hybrid nanoparticles”; SP-HNPs) . Así, la inmovilización de biomoléculas en su superficie está suponiendo un gran avance en la inclusión de diferentes funcionalidades, proporcionando sistemas más versátiles que el uso de estas biomoléculas libres (Jin, X.; Li, J. F.; Huang, P. Y.; Dong, X. Y.; Guo, L. L.; Yang, L.; Cao, Y. C.; Wei, F.; Zhao, Y. D.; Chen, H., Immobilized protease on the magnetic nanoparticles used for the hydrolysis of rapeseed meals. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2010, 322, (14) , 2031-2037; Sheldon, R., Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance. Advanced Synthesis & Catalysis 2007, 349, (8-9) , 1289-1307) .

La funcionalización de la superficie de las SP-HNPs con biomoléculas se puede llevar a cabo por diversos mecanismos: adsorción-entrecruzamiento, encapsulación, interacciones iónicas o uniones covalentes. No obstante, es bien conocido que la unión por interacciones de tipo iónico depende en gran medida del medio de reacción (pH y fuerza iónica) y, en la mayoría de los casos, llevan asociados una modificación de las propiedades características de la biomolécula tras su inmovilización.

La forma más simple de producir SP-HNPs consiste en la encapsulación de nanopartículas magnéticas de carácter lipófilo en una matriz polimérica. Existen gran variedad de nanopartículas magnéticas lipofílicas que se pueden usar, no obstante, las nanopartículas de magnetita recubiertas con ácido oleico (y-Fe3O4-OA) son las que más se usan ya que con un protocolo sencillo y barato se obtienen nanopartículas (entre 10 y 20 nm) súper-paramagnéticas, monodispersas y biocompatibles (Chorny, M.; Hood, E.; Levy, R. J.; Muzykantov, V. R., Endothelial deliver y of antioxidant enzymes loaded into non-polymeric magnetic nanoparticles. Journal of Controlled Release 2010, 146, (1) , 144-151; Sun, J.; Zhou, S.; Hou, P.; Yang, Y.; Weng, J.; Li, X.; Li, M., Synthesis and characterization of biocompatible Fe3O4 nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2007, 80A, (2) , 333-341) .

El encapsulamiento de y-Fe3O4-OA en una matriz polimérica se puede llevar a cabo mediante precipitaciónevaporación, miniemulsion-evaporación, polimerización por precipitación, polimerización por miniemulsión o polimerización por emulsión (Medina-Castillo, A. L.; Mistlberger, G.; Fernandez-Sanchez, J. F.; Segura-Carretero, A.; Klimant, I.; Fernandez-Gutierrez, A., Novel Strategy To Design Magnetic, Molecular Imprinted Polymers with Well-Controlled Structure for the Application in Optical Sensors. Macromolecules 2010, 43, (1) , 55-61) ; Gong, T.; Yang, D.; Hu, J. H.; Yang, W. L.; Wang, C. C.; Lu, J. Q., Preparation of monodispersed hybrid nanospheres with high magnetite content from uniform Fe3O4 clusters. Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects 2009, 339, (1-3) , 232-239) , pero en todos los casos una adecuada selección de la matriz polimérica a usar en la encapsulación es crucial para la obtención de adecuadas SP-HNPs. La matriz polimérica define la química de la superficie de la partícula y debe permitir la inmovilización y/o co-inmovilización ulterior de biomoléculas y otros compuestos, también es responsable de la forma en la que la magnetita queda encapsulada.

Por lo tanto se hace necesario encontrar o desarrollar nuevos compuestos que solventen todos los problemas anteriormente enunciados y que además su procedimiento de obtención permita obtener encapsulaciones elevadas y homogéneas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe nuevos compuestos poliméricos de naturaleza súper-paramagnética que mejora lo ya existente y solventa los problemas técnicos de los desarrollos actuales. Mediante estos nuevos compuestos, se proporciona una técnica de inmovilización que no requiere ninguna estrategia de activación y que combina las propiedades de las SP-HNPs como soporte con la reactividad de la función vinilsulfona con grupos presentes de forma natural en las biomoléculas (amino y tioles) en condiciones de reacción suaves compatibles con su naturaleza biológica.

El uso de las SP-HNPs como material para soportar grupos vinilsulfona supone una serie de importantes... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula general (I) :

donde:

X se selecciona entre un átomo de oxigeno o uno de nitrógeno, de tal manera que cuando X es O, el grupo R1 no existe;

R1 se selecciona entre H, un radical sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo formado por un grupo alquilo C1-C20, lineal o ramificado, alcoxialquilo o polietilenglicol;

R2 es un radical sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo formado por un radical alquilo - (CH2) n, un radical dialquilarilo (C1-C10) Ar (C1-C10) ó un radical - (CH2CH2O) nCH2CH2; donde n toma valores de 2 a 20;

Y se selecciona entre un átomo de oxigeno, de azufre o de nitrógeno de tal manera que cuando Y es O ó S, el grupo R3 no existe;

R3 es un radical sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo formado por un radical alquilo C1-C20 lineal o 15 ramificado, un resto de polietilenglicol, un resto de hidroxialquilo o un resto de alcoxialquilo;

Z puede existir o no y si existe es un grupo –SO2R4-, R4 puede o no existir, pero si existe es un radical sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo formado por un radical alquilo C1-C10, un radical dialquilarilo (C1-C10) Ar (C1-C10) ó un radical (CH2CH2O) nCH2CH2; donde n toma valores de 2 a 20;

representa materiales tanto orgánicos, como inorgánicos e híbridos formados por la combinación de los anteriores; y representa el polímero resultante de la polimerización de un monómero acriloilo junto con un entrecruzador.

2. El compuesto según la reivindicación 1, donde R1 es un átomo de H.

3. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde R2 es un radical - (CH2) n donde n toma valores de entre 2 a 10.

4. El compuesto según la reivindicación 3, donde n toma valores de 2 a 5.

5. El compuesto según la reivindicación 4, donde n toma el valor de 2.

6. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R3 es un grupo CH2CH2OH.

7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R4 es un grupo (CH2CH2O) nCH2CH2 donde n toma valores de entre 2 a 10.

8. El compuesto según la reivindicación 7, donde n toma valores de 2 a 5.

9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde

son materiales orgánicos de tipo poliméricos seleccionados del grupo formado por: poliacrilatos, polimetacrilatos, poliuretanos, poliestirenos, policarbonatos, poliacetatos, polivinilos, lineales o con diferente grado de entrecruzamiento 10. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde

son materiales inorgánicos seleccionados del grupo formado por partículas de óxidos metálicos con o sin propiedades magnéticas, nanocristales semiconductores, nanopartículas de plata o nanopartículas de oro.

11. El compuesto según la reivindicación 10, donde los materiales inorgánicos son partículas de óxidos metálicos sin propiedades magnéticas seleccionados del grupo formado por óxido de silicio y óxido de titanio.

12. El compuesto según la reivindicación 10, donde los materiales inorgánicos son partículas de óxidos metálicos con propiedades magnéticas de tipo ferritas súper-paramagnéticas MFe2O4, donde M se selecciona entre Zn, Mg, Mn, Ni, Co o Fe.

13. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde

es un híbrido entre materiales orgánicos e inorgánicos.

14. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el agente entrecruzante se selecciona del grupo formado por pentaeritritol triacrilato (PETRA) , trimetilpropano trimetacrilato (TRIM) , divinilbenceno (DVB) , N, N’metilendiacrilamida, N, N’-1, 4-fenilen diacrilamida, etilen glicol dimetacrilato (EDMA) o 3, 5-bis (acriloil piperacina)

15. El compuesto según la reivindicación 14, donde el agente entrecruzante es EDMA.

16. El compuesto según la reivindicación 1, donde X es un átomo de oxígeno, R2 es un grupo (CH2) n, n es 2, Y es un átomo de nitrógeno, R3 es un grupo –CH2-CH2OH, Z no existe,

. es magnemita recubierta con ácido oleico (D-Fe3O4-OA) y el agente entrecruzante es EDMA. 10 17. Procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula general (I) de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las siguientes etapas:

a. adición de una miniemulsión de nanopartículas súper-paramagnéticas a una mezcla polimérica que comprende un monómero de fórmula general (II) y un agente entrecruzante;

O

donde X, R1, R2, Y y R3 se describen como en la reivindicación 1;

b. reacción del compuesto obtenido en la etapa a) de fórmula general (III)

con una bis-vinilsulfona para obtener el compuesto de fórmula general (I) donde y se definen como en la reivindicación 1.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, donde el agente entrecruzante se selecciona del grupo formado por pentaeritritol triacrilato (PETRA) , trimetilpropano trimetacrilato (TRIM) , divinilbenceno (DVB) , N, N’metilendiacrilamida, N, N’-1, 4-fenilen diacrilamida, etilen glicol dimetacrilato (EDMA) o 3, 5-bis (acriloil piperacina) .

19. El procedimiento según la reivindicación 18, donde el agente entrecruzante es EDMA.

20. Procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula general (II) de la reivindicación 17, que comprende el siguiente esquema de reacciones:

donde X, R1, R2 y R3

21. Uso del compuesto de fórmula general (I) de las reivindicaciones 1 a 16, como inmovilizador de biomoléculas.

22. El uso según la reivindicación 21, donde las biomoléculas se seleccionan del grupo formado por proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos o cualquier combinación de los mismos.

23. El uso según la reivindicación 22, donde las biomoléculas son enzimas que se inmovilizan mediante grupos amina y/o tiol.

24. El uso según la reivindicación 23, donde las enzimas se seleccionan del grupo formado por invertasa, avidina o 15 HRP.

25. Uso del compuesto de fórmula general (I) de las reivindicaciones 1 a 16, como soporte cromatográfico para cromatografía de afinidad.

26. Uso del compuesto de fórmula general (I) de las reivindicaciones 1 a 16, como biosensores de fibra óptica.

IRF (u.a.)

Compuesto Compuesto fórmula (I) fórmula (III)

Fig. 1a 1000 800 600 400 200 0

400 450 500 550 600 A (nm)

Fig. 1b

IRF (u.a.)

400 450 500 550 600 A (nm)

Fig. 1c

A (nm)

Fig. 1d t

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 -0.2 -0.4

0 5 10 152025 t (h)

Fig. 2

Fig. 3