COMPUESTOS MACRÓLIDOS QUE CONTIENEN BIOTINA Y GRUPO CON FOTO-AFINIDAD PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA DIANA DEL MACRÓLIDO.

Compuestos macrólidos que contienen biotina y grupo con foto-afinidad para la identificación de la diana del macrólido. Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos compuestos macrólidos representados por la estructura general I, a sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, a procedimientos e intermedios para su preparación y al uso de estos compuestos para la identificación de la diana del macrólido. Antecedentes de la invención E06755941 16-11-2011 Los antibióticos macrólidos se acumulan de forma preferente en diferentes células de sujetos, especialmente dentro de las células fagocitos tales como las células mononucleares de la sangre periférica, y los macrófagos peritoneales y alveolares. (Gladue, R. P. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33, 277-282; Olsen, K. M. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 2582·2585). Los efectos inflamatorios de algunos macrólidos han sido descritos en las publicaciones científicas. Por ejemplo, ha sido descrito el efecto anti-inflamatorio de los derivados de eritromicina (J. Antimicrob. Chemother. 1998, 41, 37-46; Solicitud de patente No. WO 00/42055) y el de los derivados de azitromicina (documento EP 0283055). Los efectos anti- inflamatorios de algunos macrólidos son conocidos también a partir de estudios in vitro e in vivo en modelos animales experimentales tales como en la peritonitis inducida por zimosán en ratones (J. Antimicrob. Chemother. 1992, 30, 339-348) y la acumulación de neutrófilos inducida por endotoxina en la tráquea de rata (J. Immunol. 1997, 159, 3395-4005). Asimismo es conocido el efecto de modulación de los macrólidos sobre citocinas tales como la interleucina 8 (IL-8) (Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1997, 156, 266- 271) y la interleucina 5 (lL-5) (documentos EP 0775489 y EP 171564). Los macrólidos tienen la propiedad de acumularse dentro de las células del sistema inmunitario concentradas en el sitio de inflamación, especialmente las células fagocíticas: Pascual A. et aI. Clin. Microbiol. Infect. 2001, 7, 65-69. (Uptake and intracellular activity of ketolide HMR 3647 in human phagocitic and non-phagocitic cells); Hand W. L. et al. Int. J. Antimicrob. Agents, 2001, 18, 419-425. (Characteristics and mechanisms of azithromycin accumulation and efflux in human polymorphonuclear leukocytes); Amsden G. W. Int. J. Antimicrob. Agents, 2001, 18, 11-15. (Advanced-generation macrolides: tissue-directed antibiotics); Johnson J. D. et al. J. Lab. S Clin. Med. 1980, 95, 429- 439. (Antibiotic uptake by alveolar macrophages); Wildfeuer A. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 75-79. (Uptake of azithromycin by various cells and its intracellular activity under in vivo conditions); Scorneaux B. et al. Poult. Sci. 1998, 77, 1510-1521. (Intracellular accumulation, subcellular distribution, and effiux of tilmicosin in chicken phagocytes); Mtairag E. M. et al. J. Antimicrob. Chemother. 1994, 33, 523-536. (Investigation of dirithromycin and erythromycylamine uptake by human neutrophils in vitro); Anderson R. et al. J. Antimicrob. Chemother. 1988, 22, 923-933. (An in-vitro evaluation of the cellular uptake and intraphagocytic bioactivity of clarithromycin (A-56268, TE- 031, a new macrolide antimicrobial agent); Tasaka Y. et al. Jpn. J. Anlibiot. 1988, 41, 836-840. (Rokitamycin uptake by alveolar macrophages); Harf R. et al. J. Antimicrob. Chemother. 1988, 22, 135-140 (Spiramycin uptake by alveolar macrophages). Los antibióticos macrólidos parecen tener un papel prometedor en el control de las enfermedades de inflamación crónica de las vías respiratorias, claramente separado de su actividad bactericida. En los últimos quince años, sus resultados satisfactorios en ensayos clínicos humanos, en particular en enfermedades tales como la panbronquiolitis difusa y la fibrosis cística, ha dado lugar a investigaciones tanto in vitro como in vivo para determinar los mecanismos por los que esta familia de antibióticos modulan la respuesta inmunitaria. Un gran número de pruebas dan a entender que los macrólidos se dirigen directamente a múltiples componentes de la cascada inflamatoria independientemente de los efectos bactericidas/bacteriostáticos. (W. C.Tsai, Current Pharmaceutical Design. 2004, 10, 3081-3093). Hay una gran necesidad de entender los mecanismos que controlan la inflamación dentro de los pulmones. Esta necesidad coincide con una revolución en la biología celular y molecular que proporcionaría los dispositivos necesarios para que los biólogos especialistas de pulmón clarifiquen los mecanismos por los que los macrólidos ejercen efectos inmunomoduladores en el caso de la inflamación pulmonar, y establezcan estrategias terapéuticas potenciales basadas en el mecanismo o mecanismos elucidados. Por ejemplo, se ha demostrado que la azitromicina se une específicamente a la 1-glicoproteína ácida del suero utilizando la diálisis en combinación con métodos de HPLC (Castearena et aI., J Chemother. 1995, 7 Suppl 4: 26-8). El marcado por foto-afinidad es una técnica en la que una entidad molecular fotoquímicamente reactiva, asociada específicamente con una biomolécula, es fotoexcitada con el fin de unir covalentemente una marca a la biomolécula, usualmente a través de intermedios (IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 2nd Edition, 1997). El marcado por foto-afinidad es una importante metodología de la ciencia biológica ampliamente utilizada para el análisis de aspectos estructurales que están relacionados con funciones específicas de los sistemas macromoleculares biológicos objetivos. El método requiere grupos fotorreactivos que generan intermedios altamente reactivos, 2   usualmente nitreno y carbeno como la estructura clave de sondas de foto-afinidad (Hatanaka Y. et aI., Heterocycles, 1993, 35, 997-1004). El uso de análogos de foto-afinidad de macrólidos permite el estudio de las interacciones proteína-macrólido a nivel molecular. La técnica de marcado por foto-afinidad se puede utilizar para determinar qué proteínas específicas de unión a macrólidos son las dianas de los fármacos. Breves descripciones de los dibujos Figura 1. Detección de 1-glicoproteína ácida. La Figura 1A presenta una mancha de plata. La Figura 1B presenta una transferencia Western. Sumario de la invención Según los conocimientos actuales de la técnica conocida y establecida, los compuestos representados por la fórmula I, que son el objeto de la presente invención, sus sales farmacológicamente aceptables y el método de su uso para identificación de proteínas no han sido descritos hasta la fecha. La presente invención proporciona, mediante el uso de un simple reactivo, conjugados macrólidos con capacidad para ser reticulados por foto-afinidad a otras moléculas, para ser receptores, y para introducir simultáneamente la biotina en el complejo covalente. Esto permite el aislamiento y/o la identificación del complejo intacto o subsiguientemente fragmentado utilizando derivados de avidina adecuados. Ninguno de los compuestos que son el objeto de la presente invención ha sido descrito para uso en el estudio de interacciones proteína-macrólido a nivel molecular. En un aspecto de la presente invención, los conjugados de la fórmula I, o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, se representan como se indica a continuación: donde M representa una subunidad de macrólido que tiene la propiedad de acumulación en las células inflamatorias, P representa una subunidad que contiene biotina y un grupo de foto-afinidad o iminobiotina y un grupo de fotoafinidad y L representa un enlazador que une covalentemente M y P. Las subunidades de macrólido adecuadas para los compuestos híbridos de la presente invención se pueden seleccionar de los macrólidos de anillo lactónico de 14 y 15 miembros, siendo los más preferidos la azitromicina y sus derivados y la eritromicina y sus derivados. Los ejemplos más específicos no limitantes de moléculas de las que se puede seleccionar la subunidad del macrólido son los siguientes antibióticos macrólidos,· incluyendo las azalidas, por ejemplo eritromicina, diritromicina, azitromicina, 9-dihidro-9-desoxo-9a-aza-9a-homoeritromicina, eritromicilamina, fluritromicina, claritromicina, oleandomicina, roxitromicina, y sus derivados, tales como los cetólidos (por ejemplo, 3-cetona), las lactamas (por ejemplo, 8a-lactamas o 9a-lactamas) y los derivados que carecen de uno o más restos de azúcar. Descripción detallada de la invención Las metodologías para la síntesis de los macrólidos anteriores no disponibles comercialmente y la manipulación sintética de los macrólidos en general son conocidas por las personas con experiencia normal en la técnica, o se pueden encontrar en: Denis A. et al. Bioorg. & Med Chern. Lett 1999, 9, 3075-3080; Agouridas C. et al. J. Med Chem. 1998, 41,4080-4100; y el documento EP0680967; Sun Or Y. et aI.... 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M representa una subunidad de macrólido de la subestructura II: en la que (i) Z y W son independientemente >C=O, >CH2, >CH-NRtRs, >NRN, >C=NRM, o un enlace, donde Rt y Rs son independientemente H o alquilo; RM es OH, OR P , alcoxi o alcoxi sustituido; RN es H, R P , alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcoxialquilo, o -C(=X)-NRtRs; y X es O o S; con la condición de que Z y W no pueden ser ambos simultáneamente >C=O, >CH-NRtRs, >CH2, >NRN, >C=NRM, ni un enlace, (ii) U e Y son independientemente H, halógeno, alquilo. o hidroxialquilo; (iii) R 1 es hidroxi, OR P , -O-S 2 , o =O; (iv) S 1 es H o un resto de azúcar en la posición C/5 de la fórmula: E06755941 16-11-2011   en la que R 8 y R 9 son ambos hidrógeno o forman juntos un enlace, o R 9 es hidrógeno y R 8 es -N(CH3)R y , en la que R y es R P , R z o -C(O)R z , donde R z es hidrógeno, cicloalquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o heteroarilo, o un alquilo sustituido con alquilo C2-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, arilo o heteroarilo; R 10 es hidrógeno o R P ; (v) S 2 es un resto de azúcar de la fórmula en la que R 3 es H o metilo y R 11 es hidrógeno, R P , -C(O)(CH2)qNR 4 R 6 , o O-R 11 es un grupo que con R 12 y con el átomo de carbono C/4" forma un grupo >C=O o epoxi; R 12 es hidrógeno o un grupo que con O-R 11 y con el átomo de carbono C/4" forma un grupo >C=O o epoxi, donde q es un número entero de 1 a 6; (vi) R 2 es H, hidroxi, grupo OR P , alcoxi o alcoxi sustituido; (vii) A es H o metilo; (viii) B es metilo o epoxi; (ix) E es H o halógeno; (x) R 3 es hidroxi, grupo OR P , alcoxi o alcoxi sustituido o R 3 es un grupo que se puede combinar con R 5 para formar un "puente" o si W o Z es >NRN, R 3 es un grupo que se puede combinar con W o Z para formar un puente"; (xi) R 4 es alquilo C1-C4; (xii) R 5 es H, hidroxi, grupo OR P , alcoxi C1-C4, alcoxi sustituido o un grupo que se puede combinar con R 3 para formar un puente; (xiii) R 6 es H o alquilo C1-C4; (xiv) R P es un grupo protector seleccionado de alquilo, alcanoilo, alcoxicarbonilo, arilmetoxicarbonilo, aroilo, arilalquilo, alquilsililo y alquilsililalcoxialquilo; donde la subunidad M tiene un sitio de unión a través del cual se une a la subunidad P mediante el grupo de enlace L, la unión de L al resto macrólido es a través de cualquiera de: a. el átomo de nitrógeno del anillo en la posición 9a, 26 E06755941 16-11-2011   b. el grupo hidroxi en la posición 11 o en la posición 6, c. el grupo 2' hidroxi o el grupo 3'amino del resto de azúcar desosamina, d. el grupo 4" hidroxi del azúcar cladinosa, o e. si el resto M es aglicona o falta uno de los grupos de azúcar desosamina y cladinosa, a través del grupo OH creado en la posición 5 o 3 del anillo del macrólido; L es una molécula de enlace representada por la fórmula IIIA o IIIB: IIIA X 1 -(CH2)m-X 2 IIIB X 1 -(CH2)m-Q-(CH2)m-X 2 en las que X 1 se selecciona de: -CH2, -CH2-NH-, -C(O)-, -OC(O)-, =N-O-, -OC(O)NH- o C(O)NH-; X 2 se selecciona de: -NH-, -CH2-, -NHC(O)-, -C(=O)-, -O- o -OC(O)-; Q es -NH-, -CH2- o -S-S-; donde cada grupo -CH2- o -NH- está opcionalmente sustituido con alquilo C1-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, C(O)R x , C(O)OR x , C(O)NHR x donde R x puede ser alquilo C1-C7, arilo o heteroarilo; los símbolos m y n son independientemente un número entero de 0 a 8 con la condición de que si Q=NH, n no puede ser cero; P representa una subunidad que contiene biotina y un grupo de foto-afinidad o iminobiotina y un grupo de fotoafinidad; donde el grupo de foto-afinidad. es arilazida, fenilazida, fluorofenilazida, nitrofluorofenilazida, para-azidoanilina, paraazidobenzoilo, arildiazirina, diazocetona o benzofenona; o una de sus sales o solvatos; alquilo representa un radical hidrocarburo monovalente, saturado, lineal o ramificado, de uno a diez átomos de carbono, insustituido o sustituido con uno hasta cinco sustituyentes seleccionados de halógeno, hidroxi, alcoxi, acilo, acilamino, ciano, amino, N-(alquil C1-C4)amino, N,N-di(alquil C1-C4)amino, arilo, heteroarilo, tiocarbonilamino, aciloxi, amidino, alquilamidino, tioamidino, aminoacilo, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarboniloxi, ariloxi, ariloxiarilo, nitro, carboxilo, carboxilalquilo, carboxil-alquilo sustituido, carboxil-cicloalquilo, carboxil-cicloalquilo sustituido, carboxilarilo, carboxil-arilo sustituido, carboxilheteroarilo, carboxil-heteroarilo sustituido, carboxilheterocíclico, carboxil-heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalcoxi, heteroariloxi, heterocicliloxi, y oxicarbonilamino, donde el término alquilo tiene el significado definido anteriormente en todos los otros grupos sustituyentes; alquenilo representa un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a diez átomos de carbono que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, insustituido o sustituido con los mismos grupos que se han definido antes para el grupo alquilo; alquinilo representa un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado, que tiene una cadena lineal o una cadena ramificada de dos a diez átomos de carbono y que contiene de uno a tres triples enlaces carbono-carbono, insustituido o sustituido con los mismos grupos que se han definido antes para el grupo alquilo; cicloalquilo representa un grupo cíclico que tiene tres a ocho átomos de carbono que tiene un único anillo opcionalmente condensado con un grupo arilo o heteroarilo, u opcionalmente condensado con un anillo saturado, el cicloalquilo está insustituido o sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, hidroxi, alquilo C1- C7, alcoxi C1-C7, ariloxi C1-C7, alquil C1-C7-tio, ariltio, alquilsulfonilo, ciano, amino primario, amino no primario, haloalquilo y alquilamino; arilo representa un grupo carbocíclico aromático insaturado que tiene 6-14 átomos de carbono que tiene un único anillo o múltiples anillos condensados, opcionalmente condensado además con un grupo alifático o arilo, el arilo está insustituido o sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, hidroxi, alquilo C1-C7, alcoxi C1-C7, 27 E06755941 16-11-2011   ariloxi C1-C7, alquil C1-C7-tio, ariltio, alquilsulfonilo, ciano, amino primario, amino no primario, haloalquilo y alquilamino; heteroarilo representa un anillo hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico que tiene de 2 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de O, S o N, opcionalmente condensado con otro heteroarilo, arilo o grupo cíclico alifático, el heteroarilo está insustituido o sustituido con los mismos sustituyentes definidos antes para el grupo arilo; y heterocíclico representa un grupo saturado o insaturado que tiene un único anillo o múltiples anillos y de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, S y O, en el que en un sistema de anillos condensados el otro anillo o anillos pueden ser arilo o heteroarilo, el grupo heterocíclico está insustituido o sustituido como se ha especificado antes para el grupo arilo. 2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que el grupo de foto-afinidad es arilazida. 3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que P se representa por la subestructura V: en la que R C es el enlace covalente con X 2 de la cadena L. 4. Un compuesto según la reivindicación 1, que tiene las siguientes características de (i) a (x): (i) Z y W son independientemente >C=O; >CH2; >CH-NRtRs donde Rt y Rs son independientemente H o metilo; >NRN donde RN es H, R P o alquilo; >C=NRM; o un enlace; (ii) U e Y son independientemente H, metilo o hidroximetilo; (iii) R 9 es hidrógeno y R 8 es -N(CH3)R y , donde R y es R P , R z o C(O)R z , donde R z es hidrógeno o ciclohexilo, alquilo C1-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, arilo o heteroarilo o alquilo sustituido con alquilo C2-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, arilo o heteroarilo; (iv) R 2 es alcoxi C1-C4; (v) E es H o flúor; (vi) R 3 es hidroxi, grupo OR P , alcoxi C1-C4; (vii) R 4 es un metilo; (viii) R 5 es metilo o etilo; 28 E06755941 16-11-2011   (ix) al menos un R P está presente y R P representa un grupo protector seleccionado de metilo, acetilo, metoxicarbonilo o terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, benzoilo, bencilo, trimetilsililo, o trimetilsililetoximetilo; (x) R 1 es hidroxilo y S 1 es un resto azúcar de la fórmula: en la que R y es como se ha definido previamente. 5. Un compuesto según la reivindicación 1, que tiene las siguientes características de (i) a (x): (i) Z y W son independientemente >C=O; >CH2; >CH-NRtRs donde Rt y Rs son independientemente H o metilo; >NRN donde RN es H, R P o alquilo; >C=NRM; o un enlace; (ii) U e Y son independientemente H, metilo o hidroximetilo; (iii) R 9 es hidrógeno y R 8 es -N(CH3)R y , donde R y es R P , R z o C(O)R z , donde R z es hidrógeno o ciclohexilo, alquilo C1-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, arilo o heteroarilo o alquilo sustituido con alquilo C2-C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, arilo o heteroarilo; (iv) R 2 es alcoxi C1-C4; (v) E es H o flúor; (vi) R 3 es hidroxi, grupo OR P , alcoxi C1-C4; (vii) R 4 es un metilo; (viii) R 5 es metilo o etilo; (ix) al menos un R P está presente y R P representa un grupo protector seleccionado de metilo, acetilo, metoxicarbonilo o terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, benzoilo, bencilo, trimetilsililo, o trimetilsililetoximetilo; (x) S 1 es hidrógeno y R 1 es hidroxilo. 6. Un método para identificar una sustancia seleccionada del grupo de proteínas, péptidos o polipéptidos que tienen afinidad de unión para los macrólidos, que comprende: poner en contacto una muestra que potencialmente contiene dicha sustancia con un compuesto según la reivindicación 1, en condiciones que permitan que dicho compuesto se una a dicha sustancia; activar el grupo de foto-afinidad; y determinar si dicho compuesto se une con dicha sustancia mediante la evaluación de la fuerza de la señal por comparación con el umbral o con un estándar pre-establecido. 29 E06755941 16-11-2011   E06755941 16-11-2011