Compuestos fluorescentes para diagnóstico de infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

La presente invención describe nuevos compuestos fluorescentes análogos de alquilfosfolípidos, que contienen en su estructura grupos fluorescentes de alta fotoestabilidad y que emiten en la zona de longitudes de onda del espectro visible. Dichos compuestos se incorporan fácilmente a microorganismos, permitiendo la detección e identificación de estos organismos mediante microscopia de fluorescencia. Asimismo, los nuevos compuestos fluorescentes permiten diagnosticar de forma rápida y sencilla la presencia de microorganismos patógenos caracterizados por ser resistentes al tratamiento con alquilfosfolípidos

Compuestos fluorescentes para diagnóstico de infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

Composiciones farmacéuticas para el diagnóstico clínico de enfermedades infecciosas, preferentemente oculares y para identificar la presencia de microorganismos.

Estado de la técnica

La prevención y el correcto tratamiento de algunas de las enfermedades que afectan al ojo requiere la identificación de una gran variedad de microorganismos susceptibles de producir infecciones en dicho órgano. Muchas de estas infecciones oculares pueden tener consecuencias muy graves para la visión del paciente infectado, si no se diagnostican y tratan tempranamente. Con este fin es necesario en algunos casos llevar a cabo la detección del agente infeccioso directamente en el órgano infectado, extrayendo del ojo fragmentos representativos del tejido susceptible de infección (biopsia) o analizando fluidos fisiológicos en contacto con dichos tejidos (lágrima, en este caso). Los métodos habituales para la detección de microorganismos en las muestras citadas se basan, frecuentemente, en realizar cultivos que incrementen la población del posible microorganismo patógeno, para facilitar su posterior identificación. Estos cultivos pueden requerir períodos de tiempo prolongados, de 1-4 días, durante los cuales no se puede tratar al paciente con medicamentos específicos para su infección, al desconocerse el organismo causal de la misma. Estos tiempos de espera tan dilatados pueden llegar a tener consecuencias de extrema gravedad para el órgano infectado, por lo que sería de gran utilidad disponer de métodos alternativos de detección que disminuyan considerablemente el tiempo necesario para realizar el correcto diagnóstico.

Por otra parte, para la prevención de este tipo de infecciones es muy importante que aquellos elementos que eventualmente puedan estar en íntimo contacto con el ojo durante largos períodos de tiempo, tales como las lentes de contacto y los líquidos de lavado correspondientes, se conserven y utilicen en condiciones de higiene elevada que aseguren su esterilidad. De forma análoga a lo descrito más arriba, para poder obtener información fiable sobre la posible contaminación de dichas prótesis oculares y de los medios de conservación de las mismas, frecuentemente es necesario recurrir a laboriosos métodos de cultivo de microorganismos. La complejidad de las actuales técnicas de diagnóstico de estos materiales, basadas en cultivos celulares limitan en este caso tanto la frecuencia como la extensión de su aplicación, con el consiguiente aumento del riesgo de infección para los usuarios.

Asimismo, se han desarrollado técnicas alternativas de detección de microorganismos infecciosos de tipo fluorimétrico, basadas en el uso de un compuesto marcador fluorescente que se adiciona directamente al medio donde se sospecha la existencia del microorganismo. Si el compuesto marcador fluorescente se incorpora al microorganismo infeccioso, es posible determinar la presencia y morfología del mismo utilizando diversos dispositivos de visualización de fluorescencia, tales como microscopios o citómetros de flujo (Kawamoto, F., Rapid diagnosis of malaria by fluorescence microscopy with light microscope and interference filter. Lancet 1991, 337, 200-202). Como estos dispositivos permiten detectar intensidades muy pequeñas de fluorescencia, en principio es posible realizar un diagnóstico correcto con un número de células muy reducido, disminuyendo de manera considerable el tiempo requerido para dicha operación. Desgraciadamente, la utilización de este método directo de marcado fluorescente para la detección de infecciones en el ojo queda gravemente limitado por la falta de especificidad en el marcado fluorescente, causado porque la afinidad de los marcadores fluorescentes tradicionales por numerosos microorganismos patógenos de interés oftalmológico es muy similar a la afinidad por células y tejidos del ojo sano, dificultando la discriminación de la fluorescencia correspondiente a los organismos patógenos.

El objetivo de la presente invención consiste precisamente en utilizar un nuevo método sencillo y económico que permite aumentar la afinidad del marcador fluorescente por el organismo infeccioso. El nuevo método se basa en utilizar un marcador fluorescente unido a un tipo de compuestos de estructura molecular relativamente simple, que muestran mucha más afinidad por el organismo patógeno que por las células normales sanas del ojo. Estos compuestos, que se utilizan en la presente invención para la incorporación selectiva en el organismo patógeno del marcador fluorescente, pertenecen a la familia de los alquilfosfolípidos, y entre los mismos se encuentran por ejemplo miltefosina (MT), edelfosina (ET) e ilmofosina (IM) (Croft, S. L.; Engel, J., Miltefosine-discovery of the antileishmanial activity of phospholipid derivatives. Trans R Soc Trop Med Hyg 2006, 100 Suppl 1, S4-8).

Miltefosina (MT) se usa actualmente en el tratamiento de metástasis cutáneas de cáncer de mama, y se comercializa bajo el nombre de MILTEX. Además, miltefosina muestra una potente actividad antiparasitaria, por lo que se utiliza para tratamiento de la leishmaniasis humana (Soto, J.; Soto, P., Miltefosine: oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther 2006, 4, (2), 177-85) comercializándose bajo el nombre de IMPAVIDO (Zentaris S. A.) en Colombia, India y Alemania. Recientemente se ha iniciado también la utilización de MT para el tratamiento de leishmaniasis canina, utilizándose con este fin la composición comercial MILTEFORAN (Virbac). Por otro lado, se ha observado que la actividad citotóxica de MT se extiende a otros protozoos, tales como Trichomonas (Blaha, C.; Duchene, M.; Aspock, H.; Walochnik, J., In vitro activity of hexadecylphosphocholine (miltefosine) against metronidazole-resistant and -susceptible strains of Trichomonas vaginalis. J Antimicrob Chemother 2006, 57, (2), 273-8), Entamoeba histolytica (Seifert, K.; Duchene, M.; Wernsdorfer, W. H.; Kollaritsch, H.; Scheiner, O.; Wiedermann, G.; Hottkowitz, T.; Eibl, H., Effects of miltefosine and other alkylphosphocholines on human intestinal parasite Entamoeba histolytica. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45, (5), 1505-10), amebas de vida libre, como Acanthamoeba sp. o Naegleria sp. (Schuster, F. L.; Guglielmo, B. J.; Visvesvara, G. S., In-vitro activity of miltefosine and voriconazole on clinical isolates of free-living amebas: Balamuthia mandrillaris, Acanthamoeba spp., and Naegleria fowleri. J Eukaryot Microbiol 2006, 53, (2), 121-6; Walochnik, J.; Duchene, M.; Seifert, K.; Obwaller, A.; Hottkowitz, T.; Wiedermann, G.; Eibl, H.; Aspock, H., Cytotoxic activities of alkyiphosphocholines against clinical isolates of Acanthamoeba spp. Antimicrob Agents Chemother 2002, 46, (3), 695-701) patógenas para el hombre así como a otros microorganismos patógenos humanos, incluyendo hongos, levaduras (Obando, D.; Widmer, F.; Wright, L. C.; Sorrell, T. C.; Jolliffe, K. A., Synthesis, antifungal and antimicrobial activity of alkyiphospholipids. Bioorg Med Chem 2007, 15, (15), 5158-65; Widmer, F.; Wright, L. C.; Obando, D.; Handke, R.; Ganendren, R.; Ellis, D. H.; Sorrell, T. C., Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has broad-spectrum fungicidal activity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis. Antimicrob Agents Chemother 2006, 50, (2), 414-21) y Streptococcus pneumoniae (Llull, D., Rivas, L., García, E. In vitro bactericidal activity of the antiprotozoal drug miltefosine against Streptococcus pneumoniae and other pathogenic streptococci. Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51,(5):1844-8).

Se conoce muy poco sobre el mecanismo detallado mediante el cual miltefosina ejerce sus propiedades citotóxicas en los organismos citados. Los estudios más recientes sobre algunos parásitos específicos indican que posiblemente dicho mecanismo sea del tipo multi-diana, ya que la concentración intracelular de MT en los mismos es muy elevada, alcanzando en Leishmania valores en el rango milimolar (Luque-Ortega, J. R.; Rivas, L., Miltefosine (hexadecylphosphocholine) inhibits cytochrome c oxidase in Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother 2007, 51, (4), 1327-32;Saugar, J. M.; Delgado, J.; Hornillos, V.; Luque-Ortega, J. R.; Amat-Guerri, F.; Acuña, A. U.; Rivas, L., Synthesis and Biological Evaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues of Hexadecylphosphocholine (Miltefosine) as Probes of Antiparasite Mechanisms....

1. Compuesto fluorescente útil para la identificación diferencial de microorganismos caracterizado porque comprende un derivado de alquilfosfolípido y un grupo fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de longitudes de onda del espectro visible.

2. Compuesto fluorescente según la reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de alquilfosfolípido es la miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina (IM).

3. Compuesto fluorescente según la reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de alquilfosfolípido es un análogo de la miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina (IM).

4. Compuesto fluorescente según reivindicación 1 caracterizado porque el grupo fluorescente es un grupo fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de longitudes de onda del espectro visible, entre los que se encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas, oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o sin sustituyentes.

5. Compuesto fluorescente según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque el grupo fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido caracterizado por la fórmula general:

en donde:

R¹ = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido), y R² = alquil-, alquenil- o alquinil-fosfolípido.

6. Compuesto fluorescente según reivindicación 5 caracterizado porque R' es un hidrógeno o un etilo.

7. Compuesto fluorescente según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el análogo de alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP libre o sustituido, caracterizado por la fórmula general:

en donde:

R¹ = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido).

8. Compuesto fluorescente según reivindicación 7 caracterizado porque R¹ es un hidrógeno (compuesto BDP-MT) o un radical etilo (compuesto Et-BDP-MT).

9. Procedimiento de obtención de un compuesto fluorescente caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

i) obtención del correspondiente a-H-pirrol sustituido a partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,

ii) condensación del a-H-pirrol con el adecuado a-formilpirrol,

iii) reacción del dipirrometeno así formado con eterato de trifluoruro de boro,

iv) introducción del grupo fosfocolina.

10. Uso de un compuesto fluorescente según reivindicaciones 1 a 8 en la elaboración de una composición farmacéutica útil para un procedimiento de identificación de microorganismos.

11. Composición farmacéutica de diagnóstico caracterizada porque comprende un compuesto según reivindicaciones 1 a 8.

12. Composición farmacéutica de diagnóstico según la reivindicación 11 caracterizada porque comprende, al menos, uno de los siguientes compuestos: BDP-MT y Et-BDP-MT.

13. Uso de la composición farmacéutica de diagnóstico según las reivindicaciones 11 y 12 en un procedimiento de identificación de microorganismos.

14. Uso de la composición farmacéutica de diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de diagnóstico ex vivo a partir de muestras biológicas humanas o veterinarias de individuos portadores de enfermedades infecciosas pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: queratitis oculares, leishmaniasis, tripanosomiasis africana y americana, neumonía por Streptococcus pneumoniae, amebiasis, trichomoniasis y micosis.

15. Uso de la composición farmacéutica de diagnóstico según reivindicación 14 caracterizado porque la enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo perteneciente al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi Trichomonas sp., Entamoeba histolytica, Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.

16. Uso de la composición farmacéutica de diagnóstico según reivindicación 14 en un procedimiento de diagnóstico sobre una muestra biológica de origen ocular, por ejemplo, obtenida por un raspado corneal.

17. Uso de la composición farmacéutica de diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de identificación de microorganismos en muestras no humanas ni animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de preservación de córneas.