COMPUESTOS ANTITUMORALES.

La invención proporciona una serie de compuestos con estructura de diterpenoides de tipo labdano que son capaces de provocar la activación de caspasa-8 y,

por tanto, inducen la apoptosis de células tumorales. La invención se relaciona también con el uso de dicho compuestos para el tratamiento de enfermedades asociadas a una proliferación celular indeseada así como a métodos para inducir la apoptosis en células en cultivo y para la identificación de compuestos con actividad anti-apoptótica

Compuestos antitumorales.

Campo técnico de la invención

La invención se encuadra dentro del campo de la proliferación celular y, más concretamente, en el campo de compuestos capaces de inhibir la proliferación celular indeseada mediante la inducción de apoptosis.

Antecedentes de la invención

Los terpenoides suponen la clase de compuestos más extensa y abundante existente en la naturaleza. Se extraen de plantas superiores, musgos, algas y líquenes y se pueden encontrar asimismo en insectos, microbios u organismos marinos. Algunos terpenoides han sido ya empleados con propósitos terapéuticos durante siglos, y en las últimas décadas, la actividad investigadora dentro del campo clínico de esta clase de compuestos ha aumentado constantemente. Los labdanos, compuestos diterpenoides bicíclicos, muestran un amplio espectro de actividades biológicas incluyendo acción antibacteriana, antiviral y anti-inflamatoria [Chinou, I., Curr. Med. Chem., 2005, 12(11), 1295-1317]. Estos compuestos exhiben efectos anti-inflamatorios mediante la inhibición de la activación del factor de transcripción nuclear ?B (NF-?B) [Girón, N. et al.; Toxicol. Appl. Pharmacol. 2008, 228, 179-189]. Sin embargo, a día de hoy no existen datos que caractericen la posible interacción de los diterpenoides de tipo labdano con el mecanismo de muerte celular apoptótico.

La apoptosis es un proceso de suicidio celular conservado evolutivamente, esencial para la homeóstasis del tejido normal desempeñando un papel importante en la eliminación de células potencialmente dañinas, incluyendo los precursores de células tumorales [Song Z. et al., Trends Cell Biol., 1999, 9(12), M49-52]. Existen fundamentalmente dos mecanismos de inducción de apoptosis, denominados mecanismo extrínseco e intrínseco [Nicholson, DW., Cell Death Differ, 1999, 6(11), 1028-42]. El mecanismo extrínseco se inicia mediante la activación de un conjunto de receptores de superficie conocidos con el nombre de receptores de muerte. Los receptores de muerte son proteínas de membrana de tipo II, que pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), siendo los mejor caracterizados, CD95 también llamado Fas o Apo-1, TNF-R1 (receptor 1 del factor de necrosis tumoral) y TRAIL-R2 (ligando de inducción de apoptosis relacionado con TNF (del inglés TNF-related apoptosis inducing ligand).

La iniciación de los procesos apoptóticos a través de los receptores de muerte, implica el reclutamiento de moléculas adaptadoras, tales como FADD, TRADD, RAIDD, Daxx, RIP, que van a reclutar y activar a su vez a una serie de cisteinas proteasas, denominadas caspasas, en concreto a la procaspasa 8, en un complejo que señaliza la inducción de muerte (death-inducing signaling complex o DISC) [Peter, ME., Curr. Opin. Immunol., 1998, 10(5), 545-51]. La caspasa 8 activa a su vez a otros miembros de la familia, tales como las caspasas 3, 6 y 7 [Enari, M. et al, Nature, 1996, 380(6576), 723-6], poniendo en marcha una cascada de señalización que culmina con la fragmentación del DNA.

El mecanismo intrínseco está mediado por la mitocondria e involucra la liberación de factores proapoptóticos tales como el citocromo c, el factor inductor de apoptosis (AIF) y Smac/DIABLO del espacio intramembrana al citosol. Una vez liberado, el citocromo c y dATP se unen al factor-1 apoptótico activador de la proteinasa (Apaf 1) y a la procaspasa 9, formando un complejo denominado apoptosoma. Este complejo, junto con nucleótidos de adenina, provoca la autoactivación de la procaspasa-9 a caspasa 9, que a su vez, activa las caspasas 2, 3, 6, 8 y 10 [Slee, EA. et al., Cell Death Differ, 1999, 6(11), 1067-74].

Existe un nexo de unión entre los mecanismos extrínseco e intrínseco, que viene determinado por la activación de un miembro pro-apoptótico de la familia de Bcl-2, en concreto Bid. Bid es activado por la caspasa 8 mediante una ruptura proteolítica para generar un Bid truncado que activa la vía de señalización mitocondrial [Yuan, J., Cell, 1998, 94(4), 491-501].

Un mecanismo adicional de regulación de la apoptosis es el mediado por las especies reactivas de oxígeno (ROS) [Korsmeyer, SJ., Trends Genet., 1995, 11(3), 101-5]. Numerosos grupos han sugerido que la generación intracelular de ROS constituye un episodio apoptótico conservado, y se menciona la producción de ROS como un determinante crítico de la toxicidad asociada a la exposición a radiación ionizante y a fármacos quimioterapéuticos [Park, KK. et al., Mutat. Res., 2003, 542:89-97]. La mayoría de los agentes que inducen apoptosis liberan ROS, incluyendo óxido nítrico (NO), anión superóxido (O₂^-) y H₂O₂. Se han propuesto distintos mecanismos para elucidar la inducción de apoptosis mediada por ROS; un modelo bien establecido involucra la activación de la vía de señalización mitocondrial a través de la supresión del potencial mitocondrial de membrana y la liberación del citocromo c [Stridh, H. et al., FEBS Lett., 1998, 429:351-5]. Además, también se ha descrito que los ROS regulan la expresión de los receptores de muerte [Jung, EM. et al., Carcinogenesis, 2005, 26:1905-13] y activan a factores de transcripción nuclear, tales como NF-?B, AP-1 y p53, que pueden regular la expresión de las proteínas de muerte o de los inhibidores de proteínas de supervivencia [Dumont, A. et al., Oncogene, 1999, 18:(3), 747-57].

A la vista de los mecanismos involucrados en la activación de la apoptosis, es de gran importancia el desarrollo de fármacos que sean capaces de regular dichas vías de señalización y que permitan inducir la muerte celular en células de proliferación no deseada, tales como las células tumorales. Aunque se han investigado durante décadas algunos productos naturales como potenciales fármacos antitumorales [Mann, J., Nat. Rev. Cancer, 2002, 2(2), 143-8], la complejidad genética de los cánceres humanos obliga a reenfocar los esfuerzos para desarrollar nuevos fármacos multifuncionales, no solo monofuncionales, para su uso tanto terapéutico como preventivo. En este sentido, se ha demostrado recientemente que triterpenoides sintéticos de oleanano muestran pronunciados efectos sobre la inflamación y el estado redox de células y tejidos, y son potenciales agentes anti-proliferativos y proapoptóticos [Liby, KT., Nat. Rev. Cancer, 2007, 7(5), 357-69]. Otros estudios han mostrado que la inhibición de NF-?B potencia la eficacia de los efectos antitumorales de la radiación ionizante y de algunos compuestos quimioterapéuticos [Wang, CY. et al., Nat. Med., 1999, 5(4), 412-7; Wang, CY. et al., Science, 1996, 274(5288), 784-7]. NF-?B es un factor de transcripción cuya actividad se requiere para la inducción de más de 150 genes involucrados en el crecimiento, diferenciación y apoptosis celular. NF-?B está constituido por horno y heterodímeros de varias proteínas de la familia Rel, aunque las formas activas más abundantes están formadas por dímeros de p50/RelA (p50/p65). En condiciones normales, NF-?B se encuentra retenido en el citosol de las células, unido a las proteínas inhibidoras I?B que enmascaran su sitio de unión al DNA. Diversos estímulos tales como TNF-a, lipopolisacárido (LPS), IL-1, etc, son capaces de activar a las I?B quinasas, provocando la fosforilación de los I?Bs, su ubiquitinización y su degradación en el proteasoma, lo que permite que NF-?B se transloque al núcleo activando numerosos genes entre los que se encuentran también genes antiapoptóticos. Ensayos recientes indican que algunos terpenoides, incluyendo diterpenos y sesquiterpenos de tipo kaurano inhiben la vía de activación de NF-?B [Castrillo, A. et al., Biol. Chem., 2001, 276:15854-60; Lee, JH. et al., Biochem. Pharmacol., 2006, 72(10), 1311-21; Lee, JH. et al., J. Biol. Chem., 2002, 277(21), 18411-20; Lyss, G. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273(50), 33508-16], lo que puede contribuir a la inhibición de genes antiapoptóticos.

A pesar de estos estudios, existe aún la necesidad de desarrollar compuestos que permitan activar el mecanismo de muerte celular apoptótico y participar así en la eliminación de células potencialmente dañinas, incluyendo los precursores de células tumorales.

Compendio de la invención

Los autores de la presente invención han encontrado que diterpenoides de tipo labdano que responden a la fórmula (I) descrita más abajo inducen apoptosis en macrófagos y en diversas líneas tumorales tales como células Jurkat, células HT-29 y...

1. Compuesto de fórmula (I):

donde:

- - - - - - significa ausencia de enlace, un enlace sencillo o un enlace doble;

overline{text{- - - - - -}} significa un enlace sencillo o un enlace doble;

con la condición de que ambos no pueden ser a la vez un doble enlace;

R₁ y R₂ son independientemente, hidrógeno, hidroxilo, un grupo alquilo C₁-C₆ o juntos forman un grupo =O, con la condición de que uno de ellos no existe cuando overline{text{- - - - - -}} es un doble enlace;

R₃ es un grupo alquilo C₁-C₆ con la condición de que R₃ no existe cuando overline{text{- - - - - -}} es un doble enlace y el radical R₅ está ubicado en posición 3;

R₄ es hidrógeno o puede formar junto con R₆ un grupo epoxi cuando - - - - - - es un enlace sencillo; con la condición de que R₄ no existe cuando overline{text{- - - - - -}} es un doble enlace;

R₆ es hidroxilo o un grupo =O cuando - - - - - - significa ausencia de enlace, o puede formar junto con R₄ un grupo epoxi cuando - - - - - - es un enlace sencillo; con la condición de que R₆ no existe cuando - - - - - - es un enlace doble y el radical R₅ está ubicado en la posición 4;

R₅ es un grupo -(CH₂)_1-4-R₇ ubicado en la posición 3 ó 4, donde R₇ es:

o una sal, solvato o isómero farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada.

2. Compuesto según reivindicación 1, donde R₁ es hidroxilo o forma junto con R₂ un grupo =O.

3. Compuesto según reivindicaciones 1 ó 2, donde R₅ es un grupo -(CH₂)₂-R₇ ubicado en la posición 4.

4. Compuesto según reivindicación 3, donde R₇ es:

5. Compuesto según reivindicación 1 seleccionado entre los siguientes compuestos:

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la enfermedad asociada a una proliferación celular indeseada se selecciona entre cáncer, restinosis, arterioesclerosis, enfermedades angiogénicas, fibrosis, enfermedades dermatológicas y enfermedades inflamatorias.

7. Compuesto según reivindicación 6, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza, cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos e hígado.

8. Compuesto según reivindicación 6, donde las enfermedades angiogénicas se seleccionan entre retinopatía diabética, glaucoma neovascular y artritis reumatoide.

9. Compuesto según reivindicación 6, donde las enfermedades dermatológicas se seleccionan entre queloides, escaras hipertróficas, queratosis seborreica, infección por el virus de papiloma, queratosis actínica y eczema.

10. Compuesto según reivindicación 6, donde las enfermedades inflamatorias se seleccionan entre glomerulonefritis proliferativa, lupus eritomatosus, escleroderma, artritis temporal, tromboangitis y síndrome del nódulo linfático mucocutáneo.

11. Un procedimiento in vitro para inducir apoptosis en una célula que comprende poner en contacto dicha célula con un compuesto de fórmula (I) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en ausencia del lipopolisacárido LPS.

12. Procedimiento según la reivindicación 11 en donde dicha célula expresa en su superficie uno o más tipos de receptores de muerte celular.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en donde dicho receptor de muerte celular se selecciona del grupo de Fas, TNF-R1 y TRAIL.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que la célula se selecciona del grupo de una célula RAW 264.7, una célula Jurkat y una célula HT-29.

15. Un procedimiento para la identificación de inhibidores de apoptosis que comprende