Composiciones de vacunas de ADN y procedimientos para su uso.

Una composición inmunogénica de ADN contra el VIH, que comprende una molécula de ADN aislada que tieneuna secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas seleccionadas del grupo que consiste en las proteínasgag,

pro, vpx, vpr, nef y tat de VIH o VIS, capaz de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH, en la quedicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y en laque además una repetición terminal larga 3' de dicha molécula de ADN está al menos parcialmente alterada.

Composiciones de vacunas de ADN y procedimientos para su uso.

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo de las vacunas profilácticas para generar protección frente a la infección y la enfermedad inducida por el VIH-1. De modo más específico, la presente invención se refiere a vacunas de ADN contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .

Para el final del año 2000, se calculó que 36, 1 millones de personas en el mundo estaban infectadas por el VIH. Sólo en ese año, las enfermedades asociadas con VIH/SIDA se cobraron la vida de aproximadamente 3 millones de personas en el mundo. Se calcula que 500.000 de estas muertes corresponden a niños menores de 15 años. La importancia de una vacuna para el VIH con respecto a la salud mundial no puede exagerarse.

Se reconoce que unas vacunas eficaces que inhiban o eviten la infección por VIH-1 o la enfermedad inducida por VIH-1 en seres humanos serían útiles para el tratamiento de ciertas poblaciones de alto riesgo, y como vacunación profiláctica general para la población general que pueda estar en riesgo de una infección por VIH-1 o una enfermedad inducida por VIH-1. Una vacuna que confiera una protección a largo plazo frente a la transmisión del VIH-1 sería lo más útil. Por desgracia, existen muchos problemas que interfieren en el desarrollo de vacunas eficaces para la prevención de la infección y la enfermedad por VIH-1. Es muy probable que ciertos problemas sean el resultado de la naturaleza exclusiva del virus VIH-1 y sus propiedades funcionales, y hasta ahora no se ha desarrollado una vacuna eficaz (para una visión general, véase: Berzofsky et al., Developing Synthetic Peptide Vaccines for HIV-1, Vaccines, 95, pp. 135-142, 1995; Cease y Berzofsky, Toward a Vaccine for AIDS: The Emergence of Immunobiology-Based Vaccine Design, Annual Review of Immunology, 12:923-989; Berzofsky, Progress Toward Artificial Vaccines for HIV, Vaccines, 92, pp. 40-41, 1992) .

El documento US2003/0158131 informan sobre una vacuna de ADN que comprende vectores para la producción de partículas víricas de VIH no infecciosas. Las partículas no infecciosas se obtienen introduciendo una serie de mutaciones de inactivación en un genoma vírico nativo, es decir, en al menos una posición de un aminoácido de la proteína de la transcriptasa inversa (RT) o de la proteína de la integrasa (IN) . Además, la mutación en el genoma del VIH nativo puede introducirse en agrupaciones, en las que se realizan dos o más mutaciones en la proteína NC, la proteína RT, la proteína IN, o cualquiera de sus combinaciones.

Smith, J.M. et al. (Viral lmm., 13, nº 3, pp. 343-351, 2000) informan sobren el análisis de un genoma de VIS mutante que revela una delección de 1, 6 kb que está dentro de marco y abarca a integrasa, vif, vpx. Esta deleción se introdujo en el clon molecular patogénico de origen, y la región U3 de la 5’ LTR se reemplazó por un promotor de citomegalovirus para producir un candidato a vacuna de ADN, pIV.

Kotsopoulou, E. et al. (J. Virol., vol. 74, nº 10, 4839-4852, 2000) informan sobre un módulo de expresión de VIH-1gag-pol sintético (SYNGP) . Este módulo de expresión no comprende una secuencia que codifique las proteínas gap, pro, vpx, vpr, net o tat de SIV o VIH.

Seth, A. et al. (J. Virol., vol. 74, nº 6, 2502-2509, 2000) informan sobren un virus vaccinia modificado (virus de Ankara) que expresa de modo recombinante las proteínas Gag-Pol del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) .

Seth, A. et al. (PNAS, vol. 95, 10112-10116, 1998) informan sobre la utilidad de un virus vaccinia modificado (virus de Ankara) (MVA) como vector para inducir SIDA. Después de dos inmunizaciones intramusculares con MVA-SIVSM gag pol, el modelo de mono rhesus/virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) desarrolló una respuesta de CTL específica de epitopo de Gag que puede detectarse con facilidad en linfocitos de sangre periférica utilizando un ensayo de muerte funcional.

Barouch, D.H. et al. (Science, vol. 290, 486-492) y Barouch, D.H. et al. (PNAS, vol. 97, nº 8, 4192-4197, 2000) informan sobren la eficacia protectora de respuestas inmunológicas inducidas por vacunas frente a una exposición a SHIV-89.6P patogénico en monos rhesus. Las respuestas inmunológicas fueron inducidas por vacunas de ADN que expresan Gag de SIVmac239 y Env de HIV-189.6P.

El VIH es un retrovirus, lo cual significa que su genoma consiste en ARN en lugar de ADN. Existen dos cepas principales del virus, denominadas VIH-1 y VIH-2, siendo el VIH-1 la cepa principalmente responsable de la infección en seres humanos. El genoma de ARN del VIH está rodeado por una cubierta de proteínas. La combinación del genoma de ARN y la cubierta de proteínas se conoce como nucleocápsida, que a su vez está rodeada por una envuelta de proteínas y lípidos.

La infección de las células hospedantes por el VIH comienza cuando la proteína gp120 del VIH, una proteína muy glicosilada localizada en la envuelta vírica, se une a la molécula receptora CD4 de una célula hospedante. Esta interacción inicia una serie de acontecimientos que permiten la fusión entre las membranas vírica y celular y la posterior entrada del virus en la célula.

Después de entrar en la célula hospedante, el ARN del VIH es transcrito en ADN bicatenario por una enzima transcriptasa inversa vírica. Tras integrarse en el genoma hospedante, el VIH se expresa a través de transcripción por la enzima ARN polimerasa II del hospedante. A través de un control transcripcional y un procesamiento de la transcripción postranscripcional, el VIH es capaz de ejercer un alto nivel de control sobre el grado en el que se expresa.

Los estudios del virus del VIH han revelado mucha información acerca de la biología molecular del virus, incluyendo información acerca del número de genes y de las regiones genéticas importantes para la patogenicidad del VIH. Entre estos genes y regiones importantes se encuentran rt, int, vif, y la 3’ LTR del VIH.

El gen rt del VIH codifica la transcriptasa inversa vírica. Esta enzima utiliza el genoma de ARN del VIH para producir una correspondiente molécula de ADN bicatenario lineal que puede incorporarse al genoma del hospedante.

El gen int del VIH codifica una integrasa. Esta es la enzima que realmente cataliza la inserción del ADN vírico bicatenario lineal producido por la transcriptasa inversa, en el genoma del hospedante. Para completar la integración del ADN vírico en el genoma del hospedante, la maquinaria de reparación del ADN de la célula hospedante realiza un acoplamiento entre los ADN del hospedante y vírico.

El gen vif del VIH codifica una proteína conocida como “factor de infectividad vírica”. Esta proteína es necesaria para la producción de viriones infecciosos. Es probable que la proteína domine a un inhibidor celular que de otra forma inhibiría al VIH-1, y también puede potenciar la estabilidad del núcleo vírico y del complejo de preintegración.

Las regiones LTR (“long terminal repeat”, repetición terminal larga) del VIH-1 contienen regiones de promotores necesarias para conducir la expresión de los genes del VIH. La 5’ LTR del VIH-1 contiene el promotor que es principalmente responsable de conducir la expresión génica del VIH-1, aunque si la secuencia de 5’ LTR es alterada, la 3’ LTR puede asumir esta función. La 3’ LTR es necesaria para la integración del ADN vírico en el genoma del hospedante.

Otros genes importantes del VIH-1 son gag, pol, nef, y vpu.

El gen gag codifica, entre otras cosas, la proteína de la cápsica p27 del VIH. Esta proteína es importante para el ensamblaje de las nucleocápsidas víricas. También se sabe que la proteína p27 interacciona con la proteína celular CyA del VIH, que es necesaria para la infectividad vírica. Se ha demostrado que la alteración de la interacción entre p27 y CyA inhibe la replicación vírica.

El gen pol contiene las secuencias rt e int del VIH-1, por tanto codifica, entre otras cosas, la transcriptasa inversa y la integrasa.

El producto del gen nef (conocido como factor negativo, o Net) tiene una serie de propiedades potencialmente importantes. Nef tiene la capacidad de infrarregular las proteínas de clase I de MHC y CD4, siendo ambas importantes para la capacidad del cuerpo para reconocer a las células infectadas por el virus. También se ha demostrado que Nef activa a proteína quinasas celulares, interfiriendo con ello en los procesos de señalización de la célula. Quizás de modo más importante, la deleción de nef de un clon patógeno del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) hace que el virus no sea patogénico... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica de ADN contra el VIH, que comprende una molécula de ADN aislada que tiene una secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas seleccionadas del grupo que consiste en las proteínas gag, pro, vpx, vpr, nef y tat de VIH o VIS, capaz de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH, en la que dicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y en la que además una repetición terminal larga 3’ de dicha molécula de ADN está al menos parcialmente alterada.

2. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN comprende además una secuencia de promotor de VIS natural.

3. Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, derivada de un genoma vírico que codifica al menos una proteína capaz de proporcionar una respuesta inmunológica contra el VIH y que tiene una repetición terminal larga 5’ y una repetición terminal larga 3’, un gen rt, un gen int, y un gen vif, en la que la composición inmunogénica de ADN se ha hecho no patogénica mediante la alteración del gen rt, el gen int, el gen vir, y la repetición terminal larga 3’.

4. Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1.

5. Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende: (a) la 5’ LTR de VIS; (b) el gen gag de VIH; (c) el gen pro de VIH; (d) el gen vpx de VIS; (e) el gen vpr de VIS; (f) el gen nef de VIH; (g) el gen tat de VIH; (h) el gen rev de VIH; (i) el gen env de VIH; y (j) una secuencia de poliadenilación de SV40.

6. Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende una molécula de ADN aislada que tiene: (a) una secuencia de promotor procedente de la 5’ LTR de VIS que está unida operablemente: (b) una secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH seleccionada del grupo de secuencias codificadoras que consiste en los genes gag, pro, tat, rev, vpu, env, vpx, vpr y nef de VIS o VIH, en la que dicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y que contiene una alteración al menos parcial de la repetición terminal larga 3’ de dicha molécula de ADN, y que está unida operablemente; y (c) una secuencia de poliadenilación de SV40.

7. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que el promotor proviene de la 5’ LTR de VIS identificada en la presente como SEQ ID NO:7.

8. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que la secuencia que codifica la pluralidad de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica se selecciona del grupo de secuencias codificadoras que consiste en los genes gag, pro, tat, rev, vpu, env, y nef de VIH, y los genes vpx y vpr de VIS.

9. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que la secuencia de poliadenilación es la secuencia de poliadenilación de SV40 identificada en la presente como SEQ ID NO:6.

10. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 3, que comprende además una secuencia de poliadenilación sustituida en la región de la repetición terminal larga 3’ alterada.

11. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN comprende además una secuencia que codifica una citoquina.

12. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 3, que comprende además una citoquina.

13. La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 12, en la que la citoquina comprende GM-CSF.

14. Una composición inmunogénica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5, o la reivindicación 6, para su uso como una vacuna para inducir una respuesta inmunológica contra el VIH en un individuo.

15. La composición según la reivindicación 14 para según la reivindicación 14, en el que el individuo es VIH-1 positivo.

16. La composición según la reivindicación 14 para su uso según la reivindicación 14, en el que la vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. La composición según la reivindicación 14 para su uso según la reivindicación 14, en el que la composición inmunogénica de ADN comprende además una citoquina, en la que la citoquina comprende GM-CSF.