Un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a un Sitio II de un receptor de glucocorticoides (GR),

que comprende:

(a) acoplar una entidad química en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I, Tabla IV o Tabla V;

(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha entidad química y dicho Sitio II de GR; y

(c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador

Composiciones y procedimientos que implican el sitio II de los receptores nucleares de hormonas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a un sitio de unión, denominado Sitio II, en receptores nucleares de hormonas. La presente descripción describe: medios de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprenden las coordenadas de estructura del Sitio II; sistemas de ordenador capaces de producir representaciones tridimensionales de todo o cualquier parte del Sitio II; procedimientos usados en el diseño e identificación de ligandos del Sitio II y de moduladores de los receptores nucleares de hormonas (NHR); ligandos del Sitio II; moduladores de los NHR; procedimientos para modular los NHR; composiciones farmacéuticas que comprenden moduladores de NHR; moduladores de un NHR para usar en el tratamiento de enfermedades; procedimientos de diseño de mutantes; mutantes de NHR o partes de mutantes de NHR; procedimientos para medir la unión de una molécula de ensayo al Sitio II; y modelos del Sitio II.

Antecedentes de la invención

La familia de los receptores nucleares de hormonas (NHR) de factores de transcripción se unen a ligandos de bajo peso molecular y estimulan o reprimen la transcripción (en The Nuclear Receptor Facts Book, V. Laudet and H. Gronemeyer, Academic Press, pág. 345, 2002). Los NHR estimulan la transcripción uniéndose al ADN e induciendo la transcripción de genes específicos. Los NHR también pueden estimular la transcripción no uniéndose ellos mismos al ADN, si no modulando la actividad de otras proteínas que se unen al ADN (Stocklin, E., y col., Nature (1996) 383:726-8). El proceso de estimulación de la transcripción se llama transactivación. Los NHR reprimen la transcripción interaccionando con otros factores de transcripción o coactivadores e inhibiendo la capacidad de estos otros factores de transcripción o coactivadores para inducir la transcripción de genes específicos. El proceso de represión de la transcripción se llama transrepresión (para una revisión véase The Nuclear Receptor Factsbook, V. Laudet and H. Gronemeyer, Academic Press, pág. 42, 2002). Por ejemplo, se ha mostrado que el receptor de glucocorticoides, receptor de estrógenos, receptor de andrógenos y receptores a y ? activados por el proliferador de peroxisoma, reprimen la actividad de los factores de transcripción AP- 1 y NF-? (Jonat, C., y col., Cell, 62, pág. 1189-1204, (1990) Kallio, P.J., y col., Mol. Endocrinol., 9, pág. 1017-1028 (1995), Keller, E.T., y col., J. Biol. Chem., 271, pág. 26267-26275 (1996), Jones, D.C., y col., J. Biol. Chem., 277 (9), pág. 6838-6845, (2002), Ricote, M., y col., Nature, 391, pág. 79-82, (1998), Valentine, J.E., y col., J. Biol. Chem., 275, pág. 25322-25329, (2000).

La familia de receptores nucleares de hormonas incluye el receptor de glucocorticoides (Hollenberg, S.M. y col. (1985) Nature, 318, pág. 635), receptor de progesterona (Misrahi, M. y col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 143, pág. 740), receptor de andrógenos (Lubahn D. B., y col. (1988), receptores de estrógenos (Green, S., y col. (1986) Nature 320, pág. 134), receptor de mineralocorticoides (Arriza, J.L., y col., (1987) Science 237, pág. 268), receptores retinoides (RXR y RAR) (Mangelsdorf, y col. (1990) Nature, 345, pág. 224 y Petkovich M., y col. (1987) Nature 330, pág. 444), receptor de vitamina D, receptor tiroideo (TR) (Nakai, A. y col., (1988) Mol. Endocrinol. 2, pág. 1087), receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) (Greene, M.E., y col. (1995) Gene Expression 4, pág. 281), receptores nucleares huérfanos y otros. El receptor de glucocorticoides, receptor de progesterona, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos y receptor de mineralocorticoides son receptores de hormonas esteroideas (SHR).

Aunque las secuencias varían entre los diferentes receptores nucleares de hormonas, se pueden dividir en dominios funcionales que incluyen un dominio de transactivación N-terminal, un dominio de unión a ADN central y un dominio de ligando y dimerización C-terminal. Los ligandos que se unen a estos receptores actúan de una forma que depende del ligando, el tipo de célula y el promotor, e incluyen, glucocorticoides, progestinas, retinoides, mineralocorticoides y otros. Además de los esteroides, estudios recientes han mostrado que sustancias no esteroides pueden unirse a los receptores nucleares de hormonas e inducir una respuesta biológica (Coghlan, MJ, y col., J. Med. Chem. 44, pág. 2879, 2001). Se puede producir entrecruzamiento de ligandos entre los receptores, por ejemplo, la progesterona se puede unir no solo al receptor de progesterona sino también al receptor de glucocorticoides (Zhang, S., Mol. Endocrínology 10, pág. 24, 1996).

Se han elucidado las estructuras tridimensionales de algunos de los receptores nucleares de hormonas por cristalización o modelado por homología. Un modelado por homología del receptor de glucocorticoides se describe en el documento WO 00/52050, publicado el 8 de septiembre de 2000.

Publicaciones recientes del mismo grupo de investigación: Bledsoe, y col., Cell, publicación en línea de Cell Press, 1 julio, 2002, DOI:10.1016/S0092867402008176; Cell, Vol 110, 93-105, 12 de julio de 2002; y Apolito, y col., en el documento WO 03/015692 A2, publicado el 27 de febrero de 2003; describen la cristalización con éxito y elucidación estructural por rayos x del LBD del receptor de glucocorticoides en forma de dímero. Las coordenadas de estructura de rayos X se proporcionaron en el documento WO 03/015692. Se encontró que se producía la alteración de la estructura de dímero tras mutación de restos seleccionados en la interfase de la dimerización. A pesar de las similitudes estructurales con otros receptores de esteroides, el dímero de LBD de GR representa una configuración de dímero única. El LBD de GR usado para la cristalización era un mutante (F602S) diseñado para proporcionar una construcción de LBD más soluble.

Recientemente también, Kauppi y col. publicaron la estructura de LBD de GR unido a un antagonista, RU-486, en: the Journal of Biological Chemistry Online, JBC Papers In Press as DOI:10.1074/JBC.M212711200, 9 de abril, 2003; y en J. Biol. Chem, Vol. 278, Issue 25, 22748-22754, 20 de junio, 2003. En esta estructura el LBD de GR presenta un desplazamiento significativo de la hélice 12, típico de la acción antagonista. Además del LBD unido al antagonista, también se ha descrito una estructura de dímero similar a la descrita por Bledsoe y col. La estructura del complejo LBD GR-RU-486 se depositó en el RCSB (Inhz.pbd).

Las estructuras tridimensionales de otros receptores nucleares de hormonas se describen como sigue, con la referencia de RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, pdb file format) entre paréntesis: RXRalfa (1 Ibd) Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 375 pág. 377 (1995); PPAR-gamma (2prg) Nolte, R. T., Wisely, G. B., Westin, S., Cobb, J. E., Lambert, M. H., Kurokawa, R., Rosenfeld, M. G., Willson, T. M., Glass, C. K., Milburn, M. V. Nature 395 pág. 137 (1998); RARgamma (21bd) Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 378 pág. 681 (1995); PR (1a28) Williams, S. P., Sigler, P. B. Nature 393 pág. 392 (1998); VitDR (1dbl) Rochel, N., Wurtz, J. M., Mitschler, A., Klaholz, B., Moras, D. Mol. Cell 5 pág. 173 (2000); AR (1e3g) Matias, P. M., Donner, P., Coelho, R., Thomaz, M., Peixoto, C., Macedo, S., Otto, N., Joschko, S., Scholz, P., Wegg, A., Basler, S., Schafer, M., Egner, U., Carrondo, M. A. J. Biol. Chem. 275 pág. 26164 (2000); ERalpha (1a52) Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 pág. 5998 (1998); ERbeta (112j) Shiau, A. K., Barstad, D., Radek, J. T., Meyers, M. J., Nettles, K. W., Katzenellenbogen, B. S., Katzenellenbogen, J. A., Agard, D. A., Greene, G. L. Nat. Struct. Biol. 9 pág. 359 (2002). En general se cree que todos los ligandos esteroideos se unen a receptores nucleares de hormonas en el sitio de unión de ligando clásico, que se denomina Sitio I (Evans, RM. Science 240, pág. 889, 1988). Los estudios de proteólisis limitada y estudios de transfección celular/mutagénesis han delineado los dominios funcionales de receptores nucleares de hormonas que incluyen un dominio de unión al ADN, dominio de unión al ligando y un dominio de transactivación. Estos estudios proporcionaban la prueba de que las hormonas se unían al dominio...

1. Un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a un Sitio II de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:

(a) acoplar una entidad química en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I, Tabla IV o Tabla V;

(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha entidad química y dicho Sitio II de GR; y

(c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.

2. Un procedimiento de diseño de un ligando de un Sitio II de GR que comprende:

(a) modelar un Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla 1;

(b) basándose en dicho modelado, diseñar una entidad química que tenga complementaridad de las características estructurales y químicas con dicho Sitio II de GR; y

(c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.

3. Un procedimiento para identificar un modulador de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:

(a) acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;

(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y

(c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo de modulación del GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador, en el que dicho modulador de dicho GR induce transrepresión.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que además comprende uno o más de los siguientes:

(a) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio II de GR; y

(b) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I de GR.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que el modulador de GR es un compuesto disociado.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el modulador del GR antagoniza un modulador que induce transactivación.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el Sito II de GR está compuestos de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2.

8. Un procedimiento para identificar un ligando de un Sitio II de GR, que comprende:

(a) acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;

(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y

(c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador.