Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para estimular el crecimiento terapéutico de las células mecanorreceptoras del oído interno en un animal,

donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR

Composiciones y métodos para la utilización terapéutica de una secuencia asociada con el gen atonal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al campo del diagnóstico genético y de la terapia génica y, más particularmente, a la caracterización y utilización de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos asociada a atonal.

Antecedentes de la invención

Un intrincado patrón de interacciones en y entre las células dirige el desarrollo secuencial de las neuronas desde la división de las células progenitoras neuroepiteliales. Múltiples señales extracelular e intracelulares modelan este proceso. Entre las señales intracelulares clave están los factores de transcripción, los cuales inducen la expresión de una cascada de genes. Una subclase de factores de transcripción, perteneciente a la familia de proteínas con un motivo hélice-bucle-hélice básico (bHLH), es expresada muy temprano cuando se toma la decisión de proliferar o de diferenciarse. Esta función es particularmente crucial, ya que mutaciones en estos genes al principio del desarrollo pueden eliminar estructuras neurales completas.

En Drosophila, el gen atonal (ato), que es homólogo a Math1, Math2, Hath1 y Hath2, codifica una proteína bHLH esencial para el desarrollo de los órganos cordotonales (órganos sensoriales encontrados en la pared corporal, en las articulaciones y en las antenas que funcionan en la propriocepción, en el equilibrio y en la audición) (Eberl, 1999; McIver, 1985; van Staaden y Römer, 1998). Los CHOs pueblan el sistema nervioso periférico (SNP) de la pared corporal y las articulaciones (tórax, abdomen, esternón, alas, patas) y de las antenas (Moulins, 1976), proporcionando a la mosca una información sensorial muy similar a la que proporcionan el tacto y los mecanorreceptores en los vertebrados (McIver, 1985; Moulins, 1976). Boyan (Boyan, 1993) propuso que, en el curso de la evolución, diferentes CHOs se especializan para oír en diferentes insectos. Esta hipótesis fue confirmada recientemente por van Staaden y Römer (1998). En Drosophila, los CHOs del órgano de Johnston, situados en el segundo segmento de las antenas, funcionan en la audición de campo cercano (Dreller y Kirschner, 1993; Eberl, 1999) y en la geotaxis negativa.

Durante el desarrollo, ato se expresa en un grupo de células progenitoras a partir de las cuales son seleccionadas las células fundadoras de los CHO (Jarman y col., 1993). Probablemente el mismo funciona regulando la expresión de los genes necesarios para la especificación y el desarrollo del linaje de los CHO, ya que codifica una proteína con un motivo hélice-bucle-hélice básico (bHLH) que forma dímeros con la proteína "Daughterless" y se une a secuencias "E-box", activando de este modo los genes (Jarman y col., 1993). La especificidad de los CHO está codificada por el dominio básico de ato, el cual se requiere para la unión al ADN en las proteínas con bHLH (Chien y col., 1996; Davis y col., 1990; Jarman y Ahmed, 1998; Vaessin y col., 1990). El ato es necesario y suficiente para la generación de CHOs en la mosca: la pérdida de la función ato da lugar a la pérdida de CHOs, mientras que la expresión ectópica de ato produce la formación de CHOs ectópicos (Jarman y col., 1993). Las moscas adultas que carecen de la función atonal no coordinan, no vuelan y tienen una audición deficiente. La sobreexpresión del gen atonal de la mosca puede generar nuevas neuronas cordotonales, indicando que el gen atonal es esencial y suficiente para el desarrollo de esta población neuronal.

En los vertebrados, durante la miogénesis y la neurogénesis, la especificación del destino celular requiere factores de transcripción con un motivo hélice-bucle-hélice básico (bHLH). Math1 (homólogo 1 del atonal de ratón, "mouse atonal homolog-1") es uno de tales factores, y se expresa en el cerebro posterior, en la médula espinal dorsal, en la capa germinal externa del cerebelo, en el intestino, en las articulaciones, en el oído y en las células de Merkel de la piel (que funcionan como mecanorreceptores) (Akazawa y col., 1995; Ben-Arie y col., 1996; Ben-Arie y col., 1997). Los ratones heterozigotos para una deleción dirigida de Math1 (Math^+/-) son viables y tienen un aspecto normal, pero los ratones carentes (nulos) de Math1 (Math^-/-) mueren poco después de nacer y carecen de neuronas granulares cerebelosas.

Math1 es uno de los homólogos de ato más próximo conocidos, con un 82% de similitud de aminoácidos en el dominio bHLH y un 100% de conservación del dominio básico que determina la especificidad de reconocimiento de la diana (Ben-Arie y col., 1996; Chien y col., 1996). Math1 se expresa de manera transitoria en el SNC comenzando el día 9 embrionario (E9) en la porción dorsal del tubo neural. Math1 se expresa también en el labio rómbico del cuarto ventrículo del cerebro, donde nacen los precursores de las células granulares cerebelosas en E13-15 (Alder y col., 1996). Después de la proliferación y la diferenciación, estas células progenitoras migran para formar la capa granular externa (EGL) del primordio cerebeloso (Hatten y Heintz, 1995). Las células de la EGL proliferantes continúan expresando Math1 durante las tres primeras semanas post-natales, hasta poco antes de migrar a su destino adulto final para generar la capa granular interna (IGL) del cerebelo (Akazawa y col., 1995; Ben-Arie y col., 1996). Otro grupo de células, una pequeña población de precursores neuronales de la médula espinal dorsal, expresan Math1 durante E10-E14 (Akazawa y col., 1995; Ben-Arie y col., 1996). Estas células precursoras expresan también las proteínas con el homeodominio LIM (LH2A y LH2B), marcadores de la clase D1 de las interneuronas comisurales (Lee y col., 1998). Helms y Johnson (1998) informaron que la expresión de lacZ bajo el control de elementos reguladores de Math1 reproducía los patrones de expresión de Math1 en el cerebelo y en la médula espinal en desarrollo, y demostraron que Math1 se expresaba en precursores que dan lugar a una subpoblación de interneuronas comisurales dorsales.

Con el fin de determinar la función in vivo de Math1, los inventores generaron ratones (Math1^-/-) que carecían de la proteína MATH1. Esta mutación anulativa produce anormalidades cerebelosas importantes: la falta de proliferación y migración de las células granulares desde el labio rómbico en E14,5, y la ausencia de la EGL completa al nacimiento (Ben-Arie y col., 1997). No está claro si la agénesis de las neuronas granulares cerebelosas es debida un fallo de la especificación de los progenitores o a la incapacidad de las células para proliferar y/o diferenciarse. Los neonatos no pueden respirar y mueren poco después del nacimiento, pero no existen defectos macroscópicos en ninguno de los nervios craneales ni en los núcleos del tronco cerebral que puedan explicar el fallo respiratorio.

El hecho de que Math1 se exprese en el oído interno sugiere que la expresión de Math1 es necesaria para el desarrollo de los órganos auditivos o del equilibrio. El oído interno se forma inicialmente como un engrosamiento del ectodermo, denominado placoda ótica, entre los rombómeros 5 y 6 del cerebro posterior. La placoda ótica da lugar a neuronas del VIIIº nervio craneal y se invagina para dar lugar al otocisto, a partir del cual se desarrollará el oído interno. El oído interno maduro de los mamíferos contiene un órgano auditivo, la cóclea, y cinco órganos vestibulares: el utrículo, el sáculo y tres canales semicirculares. Los epitelios sensoriales de estos órganos constan de células pilosas mecanorreceptoras, células de soporte y terminaciones nerviosas. Las células pilosas sirven como mecanorreceptores para transformar las ondas sonoras y el movimiento de la cabeza en información auditiva y posicional. Las células pilosas y las células de soporte proceden ambas de una célula progenitora común y proliferan y se diferencian dentro del epitelio sensorial, con un número máximo de mitosis entre los días embrionarios 13 y 18 (E13-18) en los ratones. Aunque varios genes han sido implicados en el desarrollo del oído interno, tales como int2 (Mansour y col., 1993), pax2 (Torres y col., 1996) y Hmx3 (Wang y col., 1998), no se ha demostrado que se requiera ninguno de...

1. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para estimular el crecimiento terapéutico de las células mecanorreceptoras del oído interno en un animal, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.

2. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para la generación terapéutica de células pilosas del oído interno, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.

3. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de un animal con deterioro auditivo, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.

4. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la reivindicación 2 ó 3 que es formulada para inyección en el oído de dicho animal.

5. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de un animal con un trastorno del equilibrio, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.

6. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de un animal con una enfermedad de las articulaciones, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.

7. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la reivindicación 6 en la que dicha enfermedad de las articulaciones es osteoartritis.

8. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es formulada para ser administrada mediante un vehículo para la administración.

9. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la reivindicación 8, donde dicho vehículo para la administración es seleccionado de un vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector vírico adenoasociado, un plásmido, un liposoma, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un carbohidrato y una combinación de los mismos.

10. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la reivindicación 8, en la que dicho vehículo para la administración es un vector vírico o un vector no vírico.

11. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la reivindicación 8, en la que dicho vehículo para la administración es una célula.

12. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico de Math1 o Hath1.

13. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho animal es un humano.

14. La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, la cual está destinada para ser administrada después, antes o al mismo tiempo que la administración de una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica otro producto génico terapéutico.

15. Una composición que contiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal en combinación con un vector vírico como vehículo para la administración, donde dicho vehículo para la administración tiene como resultado la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal o de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal a una célula, y donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal es, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que contiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMH- GLNHAFDQLR.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho vehículo para la administración es seleccionado de un vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector adenoasociado o una combinación de los mismos.

17. Una composición que contiene: