Composiciones y métodos para la terapia y el diagnóstico de enfermedad inflamatoria del intestino.

Polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) la secuencia proporcionada en SEC ID Nº 85;

(b) el complemento de la secuencia proporcionada en SEC ID Nº 85;

(c) las secuencias que presentan al menos 75% de identidad con la secuencia de SEC ID Nº 85; y

(d) las secuencias que presentan al menos 90% de identidad con la secuencia de SEC ID Nº 85.

Composiciones y métodos para la terapia y el diagnóstico de enfermedad inflamatoria del intestino.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere de manera general a la terapia y al diagnóstico de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (denominadas colectivamente enfermedad inflamatoria del intestino, o EII) . La invención se refiere más particularmente a polipéptidos que comprenden al menos una parte de una proteína que se reconoce, y frente a la cual individuos con EII montan una respuesta inmunitaria aberrante, y a polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. Tales polipéptidos y polinucleótidos son útiles en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, vacunas, y otras composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de EII.

Descripción de la técnica relacionada La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (denominadas colectivamente enfermedad inflamatoria del intestino, o EII) son enfermedades inflamatorias crónicas del tubo gastrointestinal. Aunque las características clínicas varían algo entre estos dos trastornos, ambos se caracterizan por dolor abdominal, diarrea (con frecuencia con hemorragia) , un grupo variable de manifestaciones “extraintestinales” (tales como artritis, uveitis, cambios en la piel, etc.) y la acumulación de células inflamatorias dentro del intestino delgado y el colon (observada en muestras quirúrgicas o de biopsia patológica) .

La EII afecta tanto a niños como a adultos y presenta una distribución por edades bimodal (un máximo alrededor de 20 y otro alrededor de 40) . La EII es una enfermedad crónica de por vida, y con frecuencia se agrupa con otros trastornos denominados “autoinmunitarios” (por ejemplo artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I, esclerosis múltiple, etc.) . La EII se encuentra casi exclusivamente en los países industrializados. Los datos más recientes de la Clínica Mayo sugieren una incidencia global superior a 1 de cada 100.000 personas en los Estados Unidos, con datos de prevalencia en algunos estudios superiores a 1 de cada 1000. Hay una clara tendencia hacia el aumento de la incidencia de EII en los EE.UU. y en Europa, particularmente la enfermedad de Crohn. La base para este aumento no está clara en la actualidad. Como tal, la EII representa la 2ª enfermedad autoinmunitaria más común en los Estados Unidos (tras la artritis reumatoide) .

El tratamiento de EII es diverso. La terapia de primera línea incluye normalmente derivados de salicilato (por ejemplo 5-ASA) administrados por vía oral o por vía rectal. Las tasas de respuesta en enfermedad de Crohn sin complicaciones son de aproximadamente el 40% (en comparación con el 20% para placebo) . Los corticosteroides siguen siendo la piedra angular en el tratamiento de pacientes con enfermedad más “resistente”, a pesar de los efectos secundarios desfavorables. Las opciones de tratamiento más recientes incluyen anti-metabolitos (por

ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina) e inmunomoduladores (por ejemplo Remicade: un anticuerpo humano quimérico dirigido al receptor de TNFα) .

A pesar de la considerable investigación sobre terapias para estos trastornos, la EII sigue siendo difícil de diagnosticar y de tratar eficazmente. Además, no hay pruebas de laboratorio claras para diagnosticar la EII, ni 45 tampoco hay pruebas de laboratorio adecuadas que sirvan como “marcador sustituto” que sean útiles de manera uniforme para realizar un seguimiento del transcurso de la enfermedad en pacientes. Por consiguiente, existe una necesidad en la materia de métodos mejorados para detectar y tratar tales enfermedades inflamatorias del intestino. La presente invención cumple estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra un esquema de clones de flagelina con porcentaje de similitud con flagelina B relacionada de la bacteria ruminal anaerobia, Butyrivibrio fibrisolvens.

La figura 2a muestra análisis de inmunotransferencia de tipo Western de respuesta de anticuerpos en suero contra flagelinas recombinantes cBir-1 y Flax y fragmentos.

La figura 2b muestra la titulación de anticuerpo anti-flagelina en suero contra flagelinas recombinantes cBir-1 y Flax.

La figura 2c muestra la correlación de puntuación de colitis con anticuerpo anti-Flax en suero.

Las figuras 3a y b muestran la liberación de citocinas por donantes estimulados con flagelina.

Breve sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5

(a) la secuencia proporcionada en SEC ID Nº: 85;

(b) el complemento de la secuencia proporcionada en SEC ID Nº: 85;

(c) secuencias que presentan al menos el 75% o el 90% de identidad con la secuencia de SEC ID Nº: 85.

La presente invención, en otro aspecto, proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de polinucleótido descrita anteriormente.

La presente invención proporciona además un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en a) la secuencia mencionada en SEC ID Nº: 86; b) secuencias que presentan al menos el 70% de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 86; y c) secuencias que presentan al menos el 90% de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 86.

La invención también proporciona un fragmento de polipéptido aislado que comprende al menos 25, 50, 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de SEC ID Nº 86, siendo el fragmento de polipéptido inmunológicamente reactivo con un anticuerpo que se une al polipéptido de longitud completa de SEC ID Nº 86.

En determinadas formas de realización preferidas, los polipéptidos y/o polinucleótidos de la presente invención son inmunogénicos, es decir, pueden provocar una respuesta inmunitaria, particularmente una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria.

En la presente memoria se dan a conocer fragmentos, variantes y/o derivados de las secuencias de polipéptido y/o de polinucleótido dadas a conocer, presentando los fragmentos, variantes y/o derivados preferentemente un nivel de actividad inmunogénica de al menos aproximadamente el 50%, preferentemente al menos aproximadamente el 70% y más preferentemente al menos aproximadamente el 90% del nivel de actividad inmunogénica de una secuencia de polipéptido expuesta en SEC ID Nº: 86 o una secuencia de polipéptido codificada por una secuencia de polinucleótido expuesta en SEC ID Nº: 85.

La presente invención proporciona además polinucleótidos que codifican para un polipéptido descrito anteriormente, vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos y células huésped transformadas o transfectadas con tales vectores de expresión.

La invención proporciona además un método de preparación de un polipéptido de la invención según la reivindicación 2 que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención funcionalmente unido a una secuencia de control de la expresión en condiciones mediante las cuales se expresa el polinucleótido y se produce el polipéptido; y recuperar el polipéptido.

Otro aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos aislados, o fragmento de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente al polipéptido de SEC ID Nº: 86. En una realización de la invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En una realización adicional el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo que se ha humanizado. En formas de realización aún adicionales, los anticuerpos de la presente invención se unen a proteínas de flagelina y en una realización los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes contra 50 proteínas de flagelina. En una realización adicional, dichos anticuerpos bloquean la interacción entre una proteína de flagelina y un receptor tipo Toll. En una realización particular, el receptor tipo Toll es TLR5.

La presente invención proporciona además, en otros aspectos, proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido tal como se describió anteriormente, así como polinucleótidos que codifican para tales proteínas de 55 fusión, normalmente en forma de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, composiciones de vacuna, que comprenden un portador fisiológicamente aceptable y/o un inmunoestimulante. Las proteínas de fusión pueden comprender múltiples... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) la secuencia proporcionada en SEC ID Nº 85;

(b) el complemento de la secuencia proporcionada en SEC ID Nº 85;

(c) las secuencias que presentan al menos 75% de identidad con la secuencia de SEC ID Nº 85; y

(d) las secuencias que presentan al menos 90% de identidad con la secuencia de SEC ID Nº 85.

2. Polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) las secuencias codificadas por un polinucleótido según la reivindicación 1; y

(b) la secuencia expuesta en SEC ID Nº 86;

(c) las secuencias que presentan al menos 70% de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº 86; y

(d) las secuencias que presentan al menos el 90% de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº 86.

3. Fragmento de polipéptido aislado, que comprende al menos 25, 50, 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de SEC ID Nº 86, en el que el fragmento de polipéptido es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo que se une al polipéptido de longitud completa de SEC ID Nº 86.

4. Fragmento de polipéptido aislado según la reivindicación 3, en el que el fragmento de polipéptido comprende:

(a) la región conservada amino-terminal (residuos de aminoácido 1-147) de la secuencia expuesta en SEC ID Nº 86; o

(b) la región conservada amino-terminal más la región variable (residuos de aminoácido 1-418) de la secuencia expuesta en SEC ID Nº 86.

5. Proteína de fusión que comprende un fragmento de polipéptido según la reivindicación 3 o 4.

6. Proteína de fusión que consiste en un fragmento de polipéptido según la reivindicación 4 y una etiqueta de seis histidinas (SEC ID Nº 87) .

7. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 unido funcionalmente a una secuencia de control de la expresión.

8. Célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Método de preparación de un polipéptido según la reivindicación 2, que comprende:

cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 7 en condiciones mediante las cuales se expresa el polinucleótido y se produce el polipéptido; y recuperar el polipéptido.

10. Anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al polipéptido de SEQ ID 86, en el que opcionalmente dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo un anticuerpo humano o un anticuerpo que se ha humanizado.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo es seleccionado de entre el que consiste en:

(i) un anticuerpo neutralizante contra dicho polipéptido; y

(ii) un anticuerpo que bloquea la interacción entre dicho polipéptido y un receptor tipo Toll, en el que opcionalmente dicho receptor tipo Toll es el TLR5.

12. Proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 2.

13. Composición que comprende un primer componente seleccionado de entre el grupo que consiste en portadores fisiológicamente aceptables y un segundo componente seleccionado de entre el grupo que consiste en:

(a) polipéptidos según la reivindicación 2:

(b) polinucleótidos según la reivindicación 1;

(c) anticuerpos según la reivindicación 10;

(d) proteínas de fusión según la reivindicación 12;

(e) células presentadoras de antígeno que expresan un polipéptido según la reivindicación 2.

14. Composición según la reivindicación 13, que comprende además un inmunoestimulante, en la que opcionalmente dicho inmunoestimulante es un adyuvante seleccionado de entre el grupo que consiste en adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; adyuvante 65 de Merck; AS-1, AS-2; gel de hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; una sal de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada, azúcares acilados; polisacáridos derivados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A, QS21, 4-fosfatos de aminoalquil-glucosaminida y Quil A.

15. Método de detección de la presencia de enfermedad inflamatoria del intestino en un mamífero, que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicho mamífero que comprende anticuerpos con un polipéptido según la reivindicación 2;

(b) detectar en la muestra una cantidad de anticuerpo que se une al polipéptido; y

(c) comparar la cantidad de anticuerpo unido con un valor de corte predeterminado y a partir de ello, determinar la presencia de enfermedad inflamatoria del intestino en el mamífero.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho polipéptido comprende un polipéptido de flagelina.

17. Método para diagnosticar la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) , que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero con un polipéptido según la reivindicación 2;

(b) detectar en la muestra una cantidad de anticuerpo que se une al polipéptido; y

(c) comparar la cantidad de anticuerpo unido con un valor de corte predeterminado y a partir de ello diagnosticar que el mamífero presenta EII.

18. Método de monitorización de la progresión de la enfermedad inflamatoria del intestino en un mamífero, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicho mamífero que comprende anticuerpos con un polipéptido según la reivindicación 2;

(b) detectar en la muestra una cantidad de anticuerpo que se une al polipéptido; y

(c) repetir las etapas (a) y (b) utilizando una muestra biológica obtenida del mamífero en un punto de tiempo posterior; y

(d) comparar la cantidad de anticuerpo unido en la etapa (b) con la cantidad de anticuerpo unido en la etapa (c) y a partir de ello monitorizar la progresión de la enfermedad inflamatoria del intestino en el mamífero.

19. Método según la reivindicación 15 o 17, en el que dicha muestra biológica se selecciona de entre el grupo que consiste en sueros, heces, tejido u otro material obtenido mediante colonoscopia, tejido u otro material obtenido mediante ileoscopia, tejido u otro material obtenido mediante esofagogastroduodenoscopia (EGP) , y tejido u otro material obtenido mediante cirugía.

20. Kit de diagnóstico que comprende o bien:

(a) al menos un anticuerpo según la reivindicación 10 y un reactivo de detección, en el que el reactivo de detección comprende un grupo indicador; o bien

(b) al menos uno o más polipéptidos según la reivindicación 2 y un reactivo de detección que comprende un grupo indicador y opcionalmente inmovilizado sobre un soporte sólido.

21. Kit según la reivindicación 20, en el que el reactivo de detección comprende una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina.

22. Kit según la reivindicación 20, en el que el grupo indicador se selecciona de entre el grupo que consiste en grupos radiactivos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y tintes. 10