Método in vitro o ex vivo para generar una célula mucosal del intestino que produce una proteína en respuesta a un nutriente,

que comprende: (a) poner en contacto una célula mucosal del intestino o una célula madre mucosal del intestino con un polinucleótido que comprende un elemento de control de la expresión, funcional en células mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico que codifica una proteína en condiciones que permiten la transformación de la célula in vitro o ex vivo, en el que el elemento de control de la expresión comprende un promotor del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) o un promotor de glucocinasa, cromagranina A, cromagranina B, colecistocinina, proglucagón, adenosina desaminasa, secretina, gastrina, somatostatina, motilina o grelina; y (b) identificar un transformante celular que produce la proteína de manera regulada por glucosa, sacarosa, fructosa, hidrato de carbono, polipéptido, un aminoácido o grasa, generando de este modo una célula mucosal del intestino que produce una proteína en respuesta a un nutriente

Composiciones y métodos para la expresión regulada de proteína en el intestino.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la producción regulable de proteínas en el intestino, y más particularmente a la producción regulada por un nutriente de factores reductores de la glucosa a partir de células endocrinas del intestino.

Antecedentes

Los péptidos y proteínas, en virtud de su versatilidad conformacional y especificidad funcional, se han usado para tratar un hospedante de enfermedades que incluyen diabetes, hemofilia, cáncer, trastornos cardiovasculares, enfermedades infecciosas y artritis (Russell C.S. y Clarke L.A. Clin Gent 55 (6) :389 (1999) ; Ryffel B. Biomed environ Sci 10:65 (1997) ; Koths K. Curr Opin Biotechnol 6:681 (1995) ; Buckel P. Trends Pharmacol Sci 17:450 (1996) ) . Actualmente, más de dos tercios de las medicinas biotecnológicas aprobadas son fármacos proteicos sistémicos. Con los avances recientes en el campo de la genómica funcional, la proteómica y la ingeniería genética, un número creciente de fármacos proteicos están entrando en el mercado biofarmacéutico.

Originalmente, los fármacos proteicos se purificaron a partir de tejidos animales o de suero humano. Los fármacos a base de proteínas han pasado varias etapas de mejora hasta alcanzar el estado actual de la aplicación clínica. Por ejemplo, la industria biofarmacéutica ahora usa levadura y bacterias manipuladas mediante ingeniería genética para fabricar proteínas humanas recombinantes (Scopes R.K. Biotechnol Appl Biochem 23:197 (1996) ) . Esta tecnología innovadora ha superado el riesgo para la salud y las carencias que plagaron la primera generación de fármacos proteicos, y ha mejorado consiguientemente el valor terapéutico de las proteínas. Sin embargo, a pesar de estos avances, el amplio uso de proteínas como sustancias terapéuticas todavía está impedido por dificultades a la hora de purificar proteínas recombinantes en formas activas y por el coste elevado de los procedimientos de fabricación (Berthold W. y Walter J. Biologicals 22:135 (1994) ; Scopes R.K. Biotechnol Appl Biochem 23:197 (1996) ) . Adicionalmente, los fármacos proteicos encaran barreras a su entrada en el organismo. Cuando se toman oralmente, son susceptibles de romperse por enzimas en el tubo digestivo (Wang W. J Drug Target 4:195 (1996) ; Woodley J.F. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 11:61 (1994) ) .

Otras rutas de suministro de proteínas exploradas incluyen bombas de infusión (Bremer et. al., Pharm Biotechnol 10:239 (1997) ) suministro transdérmico (Burkoth T.L. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 16:331 (1999) ) , microencapsulamiento (Cleland J.L. Pharma Biotechnol 10:1 (1997) ) e inhalación (Gonda I. J Pharm Sci 89:940 (2000) ) . Actualmente, la administración subcutánea e intravenosa mediante inyección con aguja es la ruta de elección para suministrar sustancias terapéuticas proteicas. Desafortunadamente, este modo de suministro es muy poco ideal debido a que las concentraciones de proteína a menudo no se mantienen dentro de un intervalo terapéutico, o no proporcionan cinéticas de suministro apropiadas. Además, el tratamiento efectivo con fármacos proteicos requiere habitualmente inyecciones frecuentes con agujas, que pueden causar reacciones locales y malestar, dando por tanto como resultado un mal cumplimiento por parte del paciente (Jorgensen J.T. J Pediatr Endocrinol 7:175 (1994) ) . Estos y otros factores limitan la aplicación terapéutica de muchos fármacos, y finalmente impiden su potencial comercial. Por lo tanto, es axiomático identificar nuevos métodos de suministro para sustancias terapéuticas proteicas.

La inserción de genes que codifican proteínas terapéuticas específicas en células del organismo se ha usado para resolver los problemas de suministro mencionados anteriormente a la hora de tratar enfermedades. Esta metodología se denomina terapia génica, y promete ser la nueva dirección en el suministro de proteínas. Mediante este enfoque, las células en el organismo se pueden transformar en “biorreactores”, fabricando cantidades suficientes de proteínas terapéuticas y eliminando por tanto la necesidad de inyecciones frecuentes con agujas. Actualmente, la terapia génica se puede categorizar en dos enfoques generales (Drew J. y Martin L-A. en: Lemoine N.R. (ed) Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag, New York, Capítulo 1: p. 1-10 (1999) ) .

En el primer enfoque, denominado como terapia génica in vivo, se introduce un gen en una forma que permite su absorción por las células situadas en el hospedante vivo. Por ejemplo, un gen terapéutico se empaqueta en el genoma de virus, tales como retrovirus, virus adenoasociado o adenovirus. El virus recombinante que contiene el gen terapéutico se introduce entonces en un organismo vivo y se deja infectar las células en el organismo. A través del proceso de infección, el virus incorpora su genoma, que contiene los genes terapéuticos, en la estructura genómica de la célula hospedante. Como resultado, la célula infectada expresa el gen terapéutico.

El segundo enfoque implica la transferencia in vitro de material genético a células retiradas del organismo hospedante. Tras la incorporación exitosa de un gen en el genoma de la célula, las células transformadas se implantan nuevamente en el hospedante. Este método de transferencia génica se denomina como terapia génica ex vivo.

Tanto la terapia génica in vivo como ex vivo ofrecen a los médicos el poder para añadir o modificar genes específicos que dan como resultado la cura de la enfermedad (Friedmann T. en: Friedmann T (ed) The Development of Human Gene Therapy. Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor. Capítulo 1: p. 1-20 (1999) ) . Las aplicaciones clínicas de esta tecnología están siendo estudiadas en un amplio intervalo de enfermedades, incluyendo cáncer, trastornos cardiovasculares, enfermedades metabólicas, trastornos neurodegenerativos, trastornos inmunitarios y otras enfermedades genéticas o adquiridas ( (Friedmann T. en: Friedmann T (ed) The Development of Human Gene Therapy. Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor. Capítulo 1: p. 120 (1999) ; Drew J. y Martin L-A. en: Lemoine N.R. (ed) Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag, Nueva York, Capítulo 1: p. 1-10 (1999) ) . Se han logrado concentraciones terapéuticas sostenidas de numerosas proteínas tras la introducción estable de genes que codifican las proteínas en células mediante metodologías de terapia génica. Sin embargo, para algunos trastornos, se requiere el suministro regulado de la proteína terapéutica. Por ejemplo, la terapia de sustitución de insulina para pacientes diabéticos requiere idealmente que se suministre la cantidad apropiada de insulina durante las comidas. Igualmente, la efectividad óptima de supresores del apetito se puede lograr mediante liberación dependiente de las comidas. Por lo tanto, para suministrar tales proteínas terapéuticas, es óptimo un sistema de liberación accionado por una señal o estímulo, tal como una comida.

Una enfermedad particular muy adecuada para el suministro en el tiempo es diabetes mellitus, una enfermedad metabólica debilitante provocada por la producción ausente (tipo 1) o insuficiente (tipo 2) de insulina a partir de células 1 pancreáticas (Unger, R.H. et al., Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Filadelfia (1998) ) . Las células 1 son células endocrinas especializadas que fabrican y almacenan insulina para la liberación tras una comida (Rhodes, et. al. J. Cell Biol. 105:145 (1987) ) , y la insulina es una hormona que facilita la transferencia de glucosa desde la sangre a los tejidos en los que se necesita. Los pacientes con diabetes deben monitorizar frecuentemente los niveles de glucemia, y pueden requerir múltiples inyecciones diarias de insulina para sobrevivir. Sin embargo, tales pacientes raramente logran los niveles ideales de glucosa mediante inyección de insulina (Turner, R.C. et al. JAMA 281:2005 (1999) ) . Además, la elevación prolongada de los niveles de insulina puede dar como resultado efectos secundarios perjudiciales tales como choque hipoglucémico y desensibilización de la respuesta corporal a la insulina. En consecuencia, los pacientes diabéticos todavía desarrollan complicaciones a largo plazo, tales como cardiovasculopatías, nefropatía, ceguera, daño nervioso y trastornos de curación de heridas (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998) ) .

La terapia génica representa un medio prometedor para lograr el suministro fisiológico de péptidos terapéuticos, tales como insulina para el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro o ex vivo para generar una célula mucosal del intestino que produce una proteína en respuesta a un nutriente, que comprende:

(a) poner en contacto una célula mucosal del intestino o una célula madre mucosal del intestino con un polinucleótido que comprende un elemento de control de la expresión, funcional en células mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico que codifica una proteína en condiciones que permiten la transformación de la célula in vitro o ex vivo, en el que el elemento de control de la expresión comprende un promotor del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) o un promotor de glucocinasa, cromagranina A, cromagranina B, colecistocinina, proglucagón, adenosina desaminasa, secretina, gastrina, somatostatina, motilina o grelina; y

(b) identificar un transformante celular que produce la proteína de manera regulada por glucosa, sacarosa, fructosa, hidrato de carbono, polipéptido, un aminoácido o grasa, generando de este modo una célula mucosal del intestino que produce una proteína en respuesta a un nutriente.

2. Célula mucosal del intestino aislada o cultivada que produce una proteína de manera regulada por un nutriente, en la que la expresión de la proteína es conferida por un transgén que comprende un elemento de control de la expresión, funcional en células mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico que codifica la proteína, en el que el elemento de control de la expresión comprende un promotor del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) o un promotor de glucocinasa, cromagranina A, cromagranina B, colecistocinina, proglucagón, adenosina desaminasa, secretina, gastrina, somatostatina, motilina o grelina.

3. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 2, en la que el nutriente aumenta la expresión o secreción de la proteína.

4. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 2 ó 3, en la que el ácido nucleico codifica insulina.

5. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 2 ó 3, en la que el ácido nucleico codifica leptina, GLP-1, GLP-2, colecistocinina, un antagonista de glucagón, una hormona del crecimiento, un factor de coagulación, o un anticuerpo.

6. Célula mucosal del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la célula mucosal del intestino se obtiene de un sujeto.

7. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 6, en la que el sujeto es un ser humano.

8. Célula mucosal del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que la célula mucosal del intestino se obtiene de un tejido u órgano del tubo digestivo, o se deriva de una estirpe celular de origen intestinal.

9. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 8, en la que el tejido es el estómago o el duodeno.

10. Célula mucosal del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que la célula mucosal del intestino es una célula endocrina.

11. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 10, en la que la célula endocrina es una célula K.

12. Célula mucosal del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que la célula mucosal del intestino es una célula madre o una célula no endocrina.

13. Célula mucosal del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en la que el elemento de control de la expresión, funcional en células mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico comprende además un vector.

14. Célula mucosal del intestino según la reivindicación 13, en la que el vector comprende un vector vírico.

15. Uso de una o varias células mucosales del intestino según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 para la preparación de una composición farmacéutica o dispositivo para tratar a un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, un trastorno tratable produciendo una proteína en un tejido, con lo cual dicha composición o dispositivo se va a administrar mediante implantación en dicho tejido, y en el que dicho trastorno comprende una afección hiperglucémica u obesidad o una masa corporal indeseable.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la afección hiperglucémica comprende diabetes.

17. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el que el sujeto tiene un nivel de glucosa plasmática en ayunas superior

a 110 mg/dl.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la célula mucosal del intestino expresa insulina.

19. Uso según la reivindicación 15, en el que la célula mucosal del intestino expresa leptina, GLP-1, GLP-2, colecistocinina, un antagonista de glucagón, una hormona del crecimiento, un factor de coagulación, o un anticuerpo.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el tejido es un tejido mucosal.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el tejido es un tejido no mucosal.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que el tejido no mucosal es hígado, páncreas o músculo.

23. Uso de un polinucleótido que comprende un elemento de control de la expresión, funcional en células endocrinas mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica, con lo que la producción de la proteína terapéutica en células endocrinas mucosales del intestino que comprenden células K, células L, células S, células G, células D, células I, células Mo, células Gr o células enteroendocrinas, o células madre que se diferencian en células K, células L, células S, células G, células D, células I, células Mo, células Gr o células enteroendocrinas, es inducida poniendo en contacto dichas células endocrinas mucosales del intestino o dichas células madre con glucosa, sacarosa, fructosa, hidrato de carbono, polipéptido, un aminoácido o grasa, para la preparación de una composición farmacéutica o dispositivo para tratar un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, un trastorno tratable produciendo una proteína terapéutica en un tejido mucosal, con lo que la administración de dicha composición o dispositivo a un sujeto da como resultado la transformación de células endocrinas mucosales del intestino que comprenden células K, células L, células S, células G, células D, células I, células Mo, células Gr o células enteroendocrinas, o células madre que se diferencian en células que comprenden K, células L, células S, células G, células D, células I, células Mo, células Gr o células enteroendocrinas, y en el que dicho trastorno comprende una afección hiperglucémica u obesidad o una masa corporal indeseable.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que la afección hiperglucémica comprende diabetes.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que la diabetes comprende diabetes tipo I.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que el sujeto tiene un nivel de glucosa plasmática en ayunas superior a 110 mg/dl.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que la diabetes comprende diabetes insulinodependiente.

28. Método según la reivindicación 1 o uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que el nutriente aumenta la expresión o secreción de la proteína.

29. Método o uso según la reivindicación 28, en el que la secreción de la proteína aumenta en las células endocrinas.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que el elemento de control de la expresión comprende un elemento constitutivo o regulado por un nutriente.

31. Uso según la reivindicación 30, en el que el elemento regulado por un nutriente comprende un promotor, una variante funcional del mismo, o una subsecuencia funcional del mismo.

32. Uso según la reivindicación 31, en el que el promotor comprende un promotor del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) o un promotor de glucocinasa, cromagranina A, cromagranina B, colecistocinina, proglucagón, adenosina desaminasa, secretina, gastrina, somatostatina, motilina o grelina.

33. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 23 a 32, en el que el ácido nucleico codifica insulina, leptina, GLP-1, GLP-2, colecistocinina, una hormona del crecimiento, un factor de coagulación, o un anticuerpo.

34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, en el que la célula endocrina mucosal del intestino está presente en un tejido u órgano del tubo digestivo de un sujeto.

35. Uso según la reivindicación 34, en el que el tejido es el intestino o el tubo intestinal.

36. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, en el que la célula endocrina mucosal del intestino es una célula K.

37. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 23 a 35 ó 36, en el que el elemento de control de la expresión, funcional en células endocrinas mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico comprende además un vector.

38. Método o uso según la reivindicación 37, en el que el vector comprende un vector vírico.

39. Animal transgénico no humano que produce insulina en un tejido mucosal del intestino, producción de insulina que no se produce de forma natural en el tejido mucosal del intestino del animal, producción de insulina conferida por un transgén presente en células del tejido mucosal del intestino, en el que el transgén comprende un polinucleótido que incluye un elemento de control de la expresión, funcional en células mucosales del intestino, en enlazamiento operativo con un ácido nucleico que codifica insulina, y en el que la producción de la insulina en el animal es sensible al nutriente.

40. Animal transgénico según la reivindicación 39, en el que el animal es un ratón.

41. Animal transgénico según la reivindicación 39 ó 40, en el que el elemento de control de la expresión comprende un elemento regulado por un nutriente.

42. Animal transgénico según la reivindicación 41, en el que el elemento regulado por un nutriente comprende un promotor inducible por glucosa, una variante funcional del mismo, o una subsecuencia funcional del mismo.

43. Animal transgénico según la reivindicación 42, en el que el promotor inducible por glucosa comprende un promotor del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) .

44. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en el que el ácido nucleico que codifica insulina codifica una subsecuencia funcional de insulina.

45. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, en el que el tejido mucosal del intestino es un tejido u órgano del intestino.

46. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, en el que el tejido mucosal del intestino es el estómago o el duodeno.

47. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46, en el que el tejido mucosal del intestino incluye células endocrinas.

48. Animal transgénico según la reivindicación 47, en el que la célula endocrina es una célula K.

49. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46, en el que la célula mucosal del intestino es una célula madre.

50. Animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 49, en el que el animal es resistente a desarrollar una afección hiperglucémica.

51. Animal transgénico según la reivindicación 50, en el que la afección hiperglucémica comprende diabetes.

52. Célula mucosal del intestino aislada del animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 51, que produce insulina en respuesta al nutriente.

Promotor de GIP

Gen de cromogranina A (Chga) de ratón, región promotora. ACCESO L31361

Figura 14 Gen de secretogranina II (Scg2) de Mus musculus, promotor y exón 1, secuencia completa. ACCESO AF037451

Gen de glucocinasa de Mus musculus, región de flanqueo de 5'. ACCESO U93275

Figura 15 Gen de adenosina desaminasa (ADA) de H. sapiens, región de flanqueo de 5' y exón 1 (y CDS unida) . ACCESO X02189

ARNm de Homo sapiens para pre-proinsulina. ACCESO X70508

Figura 16

Leptina (LEP) de Homo sapiens, ARNm. ACCESO XM_004625

Figura 17

Colecistocinina (CCK) de Homo sapiens, ARNm. ACCESO XM_003225

Promotor de CCK (Rata) ACCESO S70690

Figura 18 ARN mensajero humano para la hormona del crecimiento (presomatotropina) . ACCESO V00519

Figura 19 Promotor de GIP de rata -1 a -1894 pb.

figura 20