Composiciones, métodos y equipos para la detección de ácidos nucleicos del vih-1 y vih-2.

Una composición para amplificar cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-2 que pueden estar presentes en una muestra biológica,

que comprende:

(a) un primer cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 59, en el que la posición 14 está ocupada por C o T, y en el que dicho primer cebador comprende de forma opcional una secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2; y

(b) un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 61, en el que la posición 16 está ocupada por C o T, en el que la posición 20 está ocupada por A o C, y en el que dicho segundo cebador comprende de forma opcional una secuencia del segundo cebador corriente arriba que no es complementario a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

Composiciones, métodos y equipos para la detección de ácidos nucleicos del VIH-1 Y VIH-2.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención está relacionada con composiciones para amplificar los ácidos nucleicos tanto del VIH-1 como del VIH-2 utilizando cebadores con reacción cruzada con los dos analitos.

Antecedentes de la invención Aunque la pandemia de VIH/ SIDA se debe principalmente a la infección por el VIH-1, un retrovirus diferente ha emergido como causante de SIDA. Este virus llamado "VIH-2" se aisló por primera vez a partir de SIDA en el oestede África en 1986, y se detectó posteriormente como un agente infeccioso por primera vez en los Estados Unidos el año siguiente. En los Estados Unidos se han informado menos de 100 casos de VIH-2 hasta finales de 1994. A pesar de estos valores aparentemente bajos, se ha identificado el VIH-2 como un agente etiológico en crecimiento causante de enfermedades con inmunosupresión que son clínicamente indistinguibles de los casos de SIDA resultantes de una infección por VIH-1 (Kanki et al., Science 232:238 (1986) ; Kanki et al., Science 236:827 (1987) ; Clavel et al., Science 233:343 (1986) ; Clavel et al., N. Engl. J. Med. 316:1180 (1987) ) . Aunque el VIH-2 está relacionado con el VIH-1 en cuanto a su morfología y tropismo por las células CD4+, éste es claramente un virus distinto y no meramente una variante de la cubierta del VIH-1.

Además, como el VIH-2 sólo está relacionado de forma lejana con el VIH-1, con aproximadamente un 50% de aminoácidos conservados en las proteínas gag y pol y menos de un 30% de conservación en los productos génicos env, su presencia no se detecta de forma efectiva en los ensayos serológicos utilizados para la detección de la infección por VIH-1 (Constantine NT, SIDA 7:1 (1993) ; Markovitz DM, Ann. Intern. Med. 118:211 (1993) ) . En consecuencia, se han intentado desarrollar sondas de ácidos nucleicos que puedan utilizarse para detectar de forma específica los ácidos nucleicos virales del VIH-2.

De forma interesante, los genomas tanto del VIH-1 como del VIH-2 muestran una heterogeneidad de secuencia sustancial entre diferentes aislamientos. Como consecuencia de esta heterogeneidad, ha sido imposible encontrar regiones sustanciales con una conservación absoluta de la secuencia entre todos los aislamientos del VIH-1 o todos los aislamientos del VIH-2 (véase la solicitud de patente europea publicada PE 0 887 427) . Además, se han identificado numerosos aislamientos virales con secuencias de polinucleótido únicas para cada uno de estos virus, un factor que además complica la construcción de sondas para un análisis de ácidos nucleicos fiable y efectivo.

Ya que el VIH-2, como el VIH-1, también es transmisible a través de un intercambio de fluidos corporales, lo que incluye sangre y plasma, es importante poder detectar los fluidos corporales infectados antes de que los anticuerpos del virus sean detectables o los síntomas sean evidentes en un individuo infectado. Para la protección de los pacientes, que de otro modo podrían recibir un fluido corporal infectado con VIH-2 (por ejemplo sangre total o plasma durante una transfusión) , o productos derivados de sangre o plasma de donaciones, es particularmente importante detectar la presencia de virus en los fluidos corporales de donación para evitar su utilización en tales procedimientos o productos. También es importante que los procedimientos y reactivos utilizados para la detección del VIH-2 puedan detectar un número relativamente bajos de copias virales que pueden estar presentes en un individuo infectado, que puede ser un donante, durante las fases tempranas de la infección.

Se han descrito previamente ensayos y reactivos para la detección del VIH-2 en, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nº 6.020.123, 5.688.637, 5.545.726 y 5.310.651; las patentes europeas Nº PE 0404625 B1 y PE 0239425 B1; y las solicitudes de patente europea publicadas Nº PE 1026236 A2 y PE 0887427 A2.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con una composición para amplificar cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-2 que pueden estar presentes en una muestra biológica.

En un primer aspecto la composición comprende un primer cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 59, en el que la posición 14 está ocupada por C o T, y en el que dicho primer cebador comprende de forma opcional una secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH

2. Además, la composición comprende un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 61, en el que la posición 16 está ocupada por C o T, en el que la posición 20 está ocupada por A o C, y en el que dicho segundo cebador comprende de forma opcional una secuencia del segundo cebador corriente arriba que no es complementario a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

En un segundo aspecto la composición comprende un primer cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 60, en el que las posiciones 14 y 23 están independientemente ocupadas por C o T, y en el que dicho primer cebador comprende una secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2. Además, la composición comprende un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 61, en el que la posición 13 está ocupada por T o I, en el que la posición 16 está ocupada por C o T, en el que la posición 20 está ocupada por A, C o I, y en el que dicho segundo cebador comprende de forma opcional una secuencia del segundo cebador corriente arriba que no es complementario a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH

2.

También se describe aquí un método para determinar si una muestra de ensayo contiene ácidos nucleicos analito del VIH-1 o ácidos nucleicos analito del VIH-2. El método inventado incluye una primera fase en la que se combina la muestra de ensayo con un par de cebadores con reactividad cruzada. A continuación, hay un paso de amplificación en una reacción de amplificación in vitro de ácidos nucleicos de una de entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos analito del VIH-1 que pueden estar presentes en la muestra de ensayo y de una de entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos analito del VIH-2 que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. Esta reacción de amplificación de ácidos nucleicos utiliza un par de cebadores con reactividad cruzada que pueden coamplificar los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2. Los productos de la reacción pueden incluir un primer amplicón del VIH-1 y un primer amplicón del VIH-2. A continuación, hay una fase de detección en una única reacción de hibridación de uno de entre cualquiera de los primeros amplicónes del VIH-1 y de uno de entre cualquiera de los primeros amplicónes del VIH-2 que pueden haberse sintetizado en la fase de amplificación. Un resultado positivo en la reacción de hibridación indicará que la muestra de ensayo contenía al menos un ácido nucleico analito del VIH-1 o un ácido nucleico analito del VIH-2. En una realización preferible, la reacción de amplificación in vitro de ácidos nucleicos en la fase de amplificación es una reacción de TMA, una reacción de NASBA o una reacción de PCR. En otra realización preferible, la única reacción de hibridación de la fase de detección involucra la utilización de una sonda con reactividad cruzada que puede hibridar con el primer amplicón del VIH-1 o con el primer amplicón del VIH-2. Más preferiblemente, la reacción de hibridación en la fase de detección además incluye una sonda específica del VIH-1 que hibrida sólo con el primer amplicón del VIH-1 y no con el primer amplicón del VIH-2. Cuando este es el caso, una señal positiva que indica la hibridación de la sonda con reactividad cruzada junto con la ausencia de un señal positiva indicativa de hibridación de la sonda específica del VIH-1 indica que la muestra de ensayo contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-2 y no contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-1. En una realización preferible alternativa, hay una fase adicional de detección en una reacción de hibridación que incluye una sonda específica del VIH-1, sólo del primer amplicón del VIH-1, y no se detecta el primer amplicón del VIH-2. En este ejemplo, la sonda específica del VIH-1 hibrida solamente con el primer amplicón del VIH-1... [Seguir leyendo]

1. Una composición para amplificar cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-2 que pueden estar presentes en una muestra biológica, que comprende:

(a) un primer cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 59, en el que la posición 14 está ocupada por C o T, y en el que dicho primer cebador comprende de forma opcional una secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2; y

(b) un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 61, en el que la posición 16 está ocupada por C o T, en el que la posición 20 está ocupada por A o C, y en el que dicho segundo cebador comprende de forma opcional una secuencia del segundo cebador corriente arriba que no es complementario a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº 53, que de forma opcional comprende la secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el primer cebador es de hasta 60 bases de longitud, y en el que el segundo cebador está seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) Id. de Sec. Nº 47, (b) Id. de Sec. Nº 49 y

(c) Id. de Sec. Nº 50.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº 54, que de forma opcional comprende la secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el primer cebador es de hasta 60 bases de longitud, y en el que el segundo cebador es Id. de Sec. Nº 48.

6. Una composición para amplificar cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquiera de los analitos de los ácidos nucleicos de VIH-2 que pueden estar presentes en una muestra biológica, que comprende:

(a) un primer cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 60, en el que las posiciones 14 y 23 están independientemente ocupadas por C o T, y en el que dicho primer cebador comprende de forma opcional una secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2; y

(b) un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº 61, en el que la posición 13 está ocupada por C o I, en el que la posición 16 está ocupada por C o T, en el que la posición 20 está ocupada por A, C o I, y en el que dicho segundo cebador comprende de forma opcional una secuencia del segundo cebador corriente arriba que no es complementario a ninguno de los dos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº 51, que de forma opcional comprende la secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el primer cebador es de hasta 60 bases de longitud, y en el que el segundo cebador está seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) Id. de Sec. Nº 47, (b) Id. de Sec. Nº 49 y

(c) Id. de Sec. Nº 50.

9. La composición de la reivindicación 6, en la que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº 52, que de forma opcional comprende la secuencia del primer cebador corriente arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que el primer cebador es de hasta 60 bases de longitud, y en el que el segundo cebador es Id. de Sec. Nº 48.