Composiciones con actividad trombolítica que comprenden ADAMTS13.

Composición farmacéutica que tiene actividad trombolítica, que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula quimérica que incluye ADAMTS13 e Ig.

Composiciones con actividad trombolítica que comprenden ADAMTS13.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que tienen actividad trombolítica que comprenden una cantidad farmacéutica efectiva de una molécula quimérica que incluye ADAMTS13 e Ig, a la utilización de dicha molécula quimérica para tratar o prevenir trastornos asociados a la formación y/o a la presencia de uno o más trombos, así como para desintegrar uno o más trombos en un paciente que lo necesita.

La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es un trastorno caracterizado por microangiopatía trombótica, trombocitopenia y trombosis microvascular, que puede provocar varios grados de isquemia o infarto tisular. Clínicamente, los pacientes de PTT son diagnosticados por síntomas como trombocitopenia, esquistocitos (fragmentos de eritrocitos) y altos niveles de lactato-deshidrogenasa (Moake JL., Thrombotic microangiopathies, N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake JL. von Willebrand factor, ADAMTS-13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol., 2004; 41: 4-14; Sadler JE, Moake JL, Miyata T, George JN., Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 2004: 407-423; Sadler JE., New concepts in von Willebrand disease, Annu Rev Med. 2005; 56: 173-191) . En 1982, Moake y col. descubrieron multímeros del factor von Willebrand (UL-vWF) anormalmente grandes en el plasma de pacientes con PTT crónica recurrente (Moake JL, Rudy CK, Troll JH, Weinstein MJ, Colannino NM, Azocar J, Seder RH, Hong SL, Deykin D., Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura, N Engl J Med. 1982; 307: 14321435) . El vínculo entre el vWF-UL y la PTT se vio apoyado por los descubrimientos independientes de Furlan y col., así como de Tsai y Lian, de que la mayoría de los pacientes que padecen PTT carecen de la metaloproteasa plasmática que segmenta el vWF (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B., Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura, Blood. 1997; 89:30973103; Tsai HM, Sussman, II, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma JJ, Nagel RL., Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q: inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP-1. Blood, 1997; 89: 1954-1962; Tsai HM, Lian EC., Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura, N Engi J Med. 1998; 339: 1585-1594) . La proteasa pertenece a la familia ADAMTS y se denomina ADAMTS13 (A Disintegrin-like And Metalloprotease with Thrombospondin type I repeats - Desintegrina y Metaloproteasa con Repeticiones de Trombospondina Tipo I) , proteína glicosilada de 190 kDa producida predominantemente por el hígado (Levy GG, Nichols WC, Lian EC, Foroud T, McClintick JN, McGee BM, Yang AY, Siemieniak DR, Stark KR, Gruppo R, Sarode R, Shurin SB, Chandrasekaran V, Stabler SP, Sabio H, Bouhassira EE, Upshaw JD, Jr., Ginsburg D, Tsai HM., Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura, Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D., Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family, Blood. 2001; 98: 1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama TK, Majerus EM, Sadler JE, Fujikawa K., Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) , a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura, J Biol Chem. 2001; 276: 41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C., A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease? J. Biochem (Tokyo) . 2001; 130: 475-480; Gerritsen HE, Robles R, Lammle B, Furlan M., Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease, Blood. 2001; 98: 1654-1661) . Se ha demostrado que mutaciones en el gen ADAMTS13 provocan PTT (Levey GG, Nichols WC, Lian EC, Foroud T, McClintick JN, McGee BM, Yang AY, Siemieniak DR, Stark KR, Gruppo R, Sarode R, Shurin SB, Chandrasekaran V, Stabler SP, Sabio H, Bouhassira EE, Upshaw JD, Jr., Ginsburg D, Tsai HM., Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura, Nature 2001; 413: 488-494) . La PTT idiopática, a menudo causada por autoanticuerpos que inhiben la actividad de ADAMTS-13, es un trastorno muy común que aparece en adultos y al final de la adolescencia y puede ser recurrente a intervalos regulares en el 11-36% de los pacientes (Tsai HM, Lian EC., Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura, N Engl J Med. 1998; 339: 1585-1594; Furlan M, Lammie B., Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514) . Los autoanticuerpos no neutralizantes también podrían inhibir la actividad de ADAMTS induciendo su eliminación de la circulación (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Ptaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M., Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura, Blood. 2003; 102:3241-3243) . La actividad de ADAMTS13 en plasma en adultos sanos oscila entre el 50% y el 178% (Moake JL., Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome, Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433) . En la mayoría de los pacientes con PTT familiar o adquirida, la actividad de ADAMTS13 en plasma está ausente o es inferior al 5% de la normal. Sin tratamiento, el coeficiente de mortalidad supera el 90%, pero la terapia de plasma ha reducido la mortalidad al 20% aproximadamente (Moake. JL., Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome, Arch Pathol Lab Med. 2002; 126: 1430-1433) .

El vWF sintetizado en megacariocitos y células endoteliales se almacena en los gránulos alfa plaquetarios y en los cuerpos de Weibel-Palade, respectivamente, como vWF extragrande (vWF-UL) 5 (Moake JL, Rudy CK, Troll JH, Weinstein My, Colannino NM, Azocar J. Seder RH, Hong SL, Deykin D., Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura, N. Engl J Med. 1982; 307: 14321435; Wagner DD, Olmsted JB, Marder VJ., Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells, J Cell Biol. 1982; 95: 355-360; Wagner DD, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium, Mayo Clin Proc. 1991; 66: 621-627; Sporn LA, Marder VJ, Wagner DD., Von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extra-cellular matrix than that secreted constitutively, Blood. 1987; 69: 1531-1534; Tsai HM, Nagel RL, Hatcher VB, Sussman, II. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases, Biochem Biophys Res Commun. 1989;

158: 980-985; Tsai HM, Nagel RL, Hatcher VB, Sussman, II., Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor, Blood. 1989; 73: 2074-2076) . Una vez secretados de las células endoteliales, estos multímeros de vWF-UL son segmentados por ADAMTS13 en circulación en una serie de multímeros más pequeños en sitios de clivaje específicos dentro de la molécula de vWF (Tsai HM, Nagel RL, Hatcher VB, Sussman, II., Entothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases, Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158: 980-985; Dent JA, Galbusera M, Ruggeri ZM., Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit, J Clin Invest. 1991; 88: 774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammie B., Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers, Proc Natl Acad Sci. U S A, 1993; 90: 7503-7507) . La proteasa se cliva en la unión Tyr842-Met843 del dominio A2 central de la subunidad madura del vWF y requiere zinc o calcio para su actividad (Dent JA, Berkowitz SD, Ware J, Kasper CK, Ruggeri ZM., Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor, Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;

87: 6306-6310) . El vWF aparece en forma de "ovillo" y filamentosa tal como se observa por microscopía electrónica (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin RI., Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que tiene actividad trombolítica, que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula quimérica que incluye ADAMTS13 e Ig.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un agente 5 antitrómbico seleccionado de entre el grupo consistente en antiplaquetas, t-PA, aspirina y heparina.

3. Molécula quimérica que comprende ADAMTS13 e Ig para su utilización en el tratamiento o la prevención de un trastorno asociado a la formación y/o presencia de uno o más trombos.

4. Molécula quimérica según la reivindicación 3, caracterizada porque el trastorno se selecciona de entre el grupo consistente en púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) hereditaria, PTT adquirida, trombosis arterial, infarto agudo

de miocardio (AMI) , derrame cerebral, sepsis, coagulación intravascular diseminada (DIC) y trombosis venosa, por ejemplo trombosis venosa profunda o embolismo pulmonar.

5. Molécula quimérica que comprende ADAMTS13 e Ig para su utilización en la desintegración de uno o más trombos en un paciente que lo necesita.

6. Molécula quimérica según una de entre las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada porque una cantidad

farmacéuticamente efectiva de la molécula quimérica que comprende ADAMTS13 e Ig oscila entre 0, 1 y 20 mg/kg de peso corporal.

Figura 1Formación de microtrombos en ratones Adamts13-/-después de superfusión con A23187

Figura 2

La infusión de ratones WT con ADAMTS13 Ab Anti-hu Policlonal imita el fenotipo A.Adamts13 -/-

Figura 3ADAMTS13 Anti-hu Policlonal induce los trombos en las microvénulas de ratones WT después de la infusión de A231872 min después de A23187

1 min después de A23187

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 9