Una composición de regeneración tisular que comprende:

(a) un primer componente que comprende fibrinógeno,

en el que el primer componente está en la forma de una pulverización;

y (b) un segundo componente que comprende trombina y células alogénicas inactivadas mitóticamente, en el que el segundo componente está en la forma de una pulverización y en el que las células comprenden uno o más queratinocitos y fibroblastos que secretan una o más moléculas biológicamente activas seleccionadas entre el grupo que consiste en GM-CSF, VEGF, KGF, bFGF, TGF , angiopoyetina, EGF, IL1 , IL-6, IL-8, TGFa, y TNFa.

Composiciones que comprenden fibroblastos y queratinocitos alogénicos inactivados mitóticamente para su utilización en la regeneración tisular Campo de la invención La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere en general a la regeneración tisular, por ejemplo, el tratamiento de heridas que usan células que secretan factor de crecimiento, citoquina, o factor angiogénico mezcladas con una matriz extracelular biológica o sintética aplicada a una herida.

Antecedentes de la invención

Heridas (es decir, laceraciones o heridas abiertas) en tejido de mamíferos puede dar como resultado la rotura del tejido y la coagulación de la microvasculatura en la cara de la herida. La reparación de tal tejido representa una respuesta celular ordenada, controlada a la lesión. Todas las heridas de tejido blando, independientemente del tamaño, cicatrizan de manera similar. Los mecanismos de crecimiento de tejido y reparación son sistemas biológicos en los que se producen proliferación celular y angiogénesis en la presencia de un gradiente de oxígeno. Los cambios morfológicos y estructurales secuenciales, que se producen durante esta reparación de tejidos se han caracterizado en gran detalle y, en algunos casos, se han cuantificado. Véase Hunt, T- K, et al., "Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing, " en The surgical wound, p. 1 - 18, ed. F. Dineen & G. Hildrick-Smith (Lea & Febiger, Philadelphia: 1981) .

La regeneración de tejido en diversos órganos, tales como, por ejemplo, la piel o el corazón depende del tejido conectivo que reestablece el suministro de sangre y permite que las células residuales específicas del órgano tales como queratinocitos o células musculares para restablecer la integridad del órgano. De este modo, una función relevante de las células mesenquimales, es decir, los fibroblastos o, además, las células endoteliales de vasculatura, es la secreción de factores que potencian el proceso de cicatrización, por ejemplo, factores que promueven la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) o factores que promueven la re- epitelialización mediante proliferación y migración de queratinocitos.

La morfología celular de una herida consiste en tres zonas distintas. El espacio de herida sin vasos central es deficiente en oxígeno, acidótico e hipercárbico, y tienen altos niveles de lactato. Adyacente al espacio de la herida es una zona de gradiente de isquemia local, que se puebla por división de fibroblastos. Detrás de la zona principal está un área de síntesis de colágeno activo caracterizada por fibroblastos maduros y numerosos capilares recién formados (es decir, neovascularización) . Aunque es necesario el crecimiento de nuevos vasos (angiogénesis) para la cicatrización de los tejidos heridos, los agentes angiogénicos en general son incapaces de cumplir la necesidad largamente sentida de proporcionar los efectos biosintéticos adicionales de reparación de tejidos. A pesar de la necesidad de una cicatrización más rápida de las heridas (es decir, quemaduras graves, incisiones quirúrgicas, laceraciones y otros traumas) , hasta ahora solamente han tenido un éxito limitado en la aceleración de la cicatrización de heridas con agentes farmacológicas.

El principal objetivo en el tratamiento de heridas es lograr el cierre de la herida. Las heridas cutáneas abiertas representan una de las principales categorías de las heridas. Esta categoría incluye las quirúrgicas y traumáticas agudas, por ejemplo, úlceras crónicas, heridas de quemaduras, así como heridas crónicas tales como úlceras neuropáticas, llagas por presión, úlceras arteriales y venosas (estasis) o arteriovenosass mixtas, y úlceras diabéticas. Las heridas cutáneas abiertas de manera rutinaria cicatrizan mediante un proceso que comprende seis componentes principales: i) inflamación, ii) proliferación de fibroblastos, iii) proliferación de vasos sanguíneos, iv) síntesis de tejido conectivo, v) epitelializción, y vi) contracción de herida. La cicatrización de herida se altera estos componentes, o bien de manera individual o en conjunto, no funcionan adecuadamente. Numerosos factores pueden afectar a la cicatrización de heridas, incluyendo malnutrición, infección, agentes farmacológicos (por ejemplo, fármacos citotóxicos y corticosteroides) , diabetes, y edad avanzada. Véase Hunt et al., en Current Surgical 45 Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange) , p. 86 - 98 (1988) .

Las heridas cutáneas que no cicatrizan fácilmente pueden provocar aflicciones físicas, emocionales y sociales considerables al sujeto así como grades gastos financieros. Véase por ejemplo, Richey et al., Annals of Plastic Surger y 23 (2) : 159 - 65 (1989) . De hecho, heridas que no cicatrizan de manera adecuada finalmente pueden requerir tratamiento quirúrgico más o menos agresivo, por ejemplo, injertos de piel autólogos. Se han desarrollado 50 numerosas modalidades de tratamiento a medida que ha progresado el entendimiento básico de heridas y mecanismos de cicatrización de heridas por los científicos.

La modalidad convencional usada más comúnmente en la cicatrización de heridas de piel implica el uso de apósitos de heridas. En los años1960, se produjo una importante ruptura en el cuidado de heridas cuando se descubrió que la cicatrización de heridas con apósitos oclusivos húmedos era, hablando en general, más eficaz que 55 el uso de apósitos no oclusivos secos. Véase Winter, Nature 193: 293 - 94 (1962) . Hoy, se usan de manera rutinaria numerosos tipos de apósitos, incluyendo películas (por ejemplo, películas de poliuretano) , hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espuma de poliuretano) , hidrogeles (polímeros reticulados que contienen aproximadamente al menos 60% de agua) , espumas (hidrófilas o hidrófobas) , alginatos de calcio (compuestos de fibras no tejidos de alginato de calcio) , y celofán (celulosa cen un plastificante) . Véase Kennon et al., Dermatol.

Surg. 21: 583 - 590 (1995) ; Davies, Bums 10: 94 (1983) . Desafortunadamente, ciertos tipos de heridas (por ejemplo, úlceras diabéticas, llagas por presión) y las heridas de ciertos sujetos (por ejemplo, receptores de corticosteroides exógenos) no cicatrizan de una manera adecuada (o completamente) con el uso de tales apósitos.

También se han utilizado varias modalidades farmacéuticas en el intento de mejorar la cicatrización de heridas. Por ejemplo, regímenes de tratamiento que implican sulfato de cinc se han utilizado por algunos facultativos. Sin 10 embargo, la eficacia de estos regímenes se ha atribuido principalmente a su inversión de los efectos de los niveels por debajo de lo normal de cinc en suero (por ejemplo, disminución de la resistencia del huésped y alteración de la actividad bactericida intracelular) . Véase Riley, Am. Fam. Physician 24:107 (1981) . Aunque otras deficiencias en vitaminas y minerales han estado asociadas a la disminución en la cicatrización de heridas (por ejemplo, deficiencias de vitaminas A, C y D; y calcio, magnesio, cobre, y hierro) , no existe una fuerte evidencia sobre que el incremento de los niveles en suero de estas sustancias por encima de niveles normales realmente potencie la cicatrización de heridas. De este modo, excepto en circunstancias muy limitadas, la promoción de la cicatrización de heridas con estos agentes ha tenido poco éxito.

Lo que se necesita es un medio seguro, eficaz, e interactivo para potenciar la cicatrización de heridas extensiva y /

o heridas difíciles de cicatrizar que se puedan usar sin tener en cuanta el tipo de herida o la naturaleza de la 20 población de pacientes.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de factores angiogénicos u otros de crecimiento o citoquinas expresados por las células humanas en preparaciones no encapsuladas (en mezcla o en combinación con material matriz o sustancias biocompatibles sintéticas) para que se apliquen de manera temporal a heridas o defectos en tejidos cutáneos u otros para el restablecimiento de tejido conectivo suministrador de sangre para permitir que las células específicas de órgano restablezcan la integridad de órgano así como para inhibir la excesiva formación de cicatrices.

La invención contempla una composición de regeneración tisular que comprende:

(a) un primer componente que comprende fibrinógeno, en el que el primer componente está en la forma de una 30 pulverización; y (b) un segundo componente que comprende trombina y células alogénicas inactivadas mitóticamente,... [Seguir leyendo]

1. Una composición de regeneración tisular que comprende:

(a) un primer componente que comprende fibrinógeno, en el que el primer componente está en la forma de una pulverización; y (b) un segundo componente que comprende trombina y células alogénicas inactivadas mitóticamente, en el que el segundo componente está en la forma de una pulverización y en el que las células comprenden uno o más queratinocitos y fibroblastos que secretan una o más moléculas biológicamente activas seleccionadas entre el grupo que consiste en GM-CSF, VEGF, KGF, bFGF, TGF , angiopoyetina, EGF, IL1 , IL-6, IL-8, TGFa, y TNFa.

10 2. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 1, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos son fibroblastos y queratinocitos diferenciados.

3. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 1, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos están mitóticamente inactivados por administración de mitomicina C u otros inhibidores mitóticos a base de química, irradiación con Rayos-y, irradiación con Rayos-X, o irradiación con luz UV.

15 4. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 1, en la que el primer componente además comprende colágeno, alginato, plasma de sangre, o quitosán.

5. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 1, en la que el segundo componente además comprende un crioprotector.

6. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 5, en la que el crioprotector se selecciona entre el

grupo que consiste en una solución al 15% de glicerol, y una solución al 15% de glicerol y albúmina sérica humana al 5%.

7. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 5, en la que el crioprotector es glicerol.

8. Un kit que comprende la composición de regeneración tisular de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El kit de la reivindicación 8, en el que el primer componente y el segundo componente están crioconservados 25 antes del transporte y posteriormente se descongelan antes de uso.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que el primero y segundo componentes están cada uno de ellos contenidos en un vial separado que tiene un tapón roscado que se puede separar, en el que el vial es estéril y está fabricado de material resistente a bajas temperaturas y en el que la tapa que se puede separar se puede reemplazar con una bomba de pulverización después de la descongelación del primero y segundo componentes antes de uso.

11. El kit de la reivindicación 10, en el que la bomba de pulverización distribuye un volumen de aproximadamente 130 Il por pulverización.

12. El kit de la reivindicación 10, en el que el material resistente a bajas temperaturas se selecciona entre el grupo que consiste en vidrio, polipropileno, polietileno, y vinil acetato de etileno (EVA) .

13. El kit de la reivindicación 10, en el que los viales se sellan con una bolsa o recipiente antes de la

crioconservación, en el que la bolsa o recipiente está fabricada de un material capaz de soportar temperaturas que varían entre -80º y -196º C y en el que la bolsa o recipiente protege el primero y segundo componentes de contaminación durante la crioconservación y posterior descongelación.

14. El kit de la reivindicación 13, en el que la bolsa o recipiente es estanco al agua y tiene un alto comportamiento de barrera.

15. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 1, en el que el segundo componente comprende entre aproximadamente 1 X 103 células/Il y aproximadamente 50 X 103 células/Il de las células alogénicas mitóticamente inactivadas.

16. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 3, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos están mitóticamente inactivados por mitomicina C.

45 17. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 3, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos están mitóticamente inactivados por radiación con Rayos-y.

18. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 3, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos

are mitóticamente inactivados por radiación con Rayos-X.

19. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 3, en la que uno o más queratinocitos y fibroblastos are mitóticamente inactivados por radiación con luz UV.

20. La composición de regeneración tisular de la reivindicación 5, en la que el crioprotector es un glicerol al 15% y 5 solución de albúmina sérica humana al 5%.

21. La composición de regeneración tisular de las reivindicaciones 1-7 y 15-20 para su uso en la regeneración de tejido, en la que la composición de regeneración tisular es para administrar por vía tópica a un sitio de herida en un paciente en necesidad de tratamiento.

22. La composición de regeneración tisular para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en la que dicho primero 10 y segundo componentes son para administración tópica al sitio de la herida en el paciente.

23. La composición de regeneración tisular para su uso de acuerdo con reivindicación 21, en la que el primero y segundo componentes son para combinar en el sitio de herida.

24. La composición de regeneración tisular para su uso de acuerdo con reivindicación 21, en la que dicho primero y segundo componentes son para combinar en el aire antes de alcanzar el sitio de la herida.

25. La composición de regeneración tisular para su uso de acuerdo con reivindicación 22, en la que dicho primer componente es para aplicar al sitio de la herida antes de que dicho segundo componente sea aplicado al sitio de la herida.