La presente invención está relacionada con una composición capazde inhibir el crecimiento de células tumorales de diferentes orígenes histológicos y de células endoteliales activadas.

Los componentes de dicha composición son fragmentos polipeptídicos de Serralisinas, correspondientes al fragmento C-terminal, a partir de lametionina interna de la secuencia hasta el final de la molécula,los cuales pueden combinarse entre ellos y opcionalmente con prodigiosinas que potencian el efecto anti-tumoral de la composición. Las prodigiosinas en la composición pueden estar a una concentración de 0.1 - 100 nM. La acción anti-proliferativa de la composición está mediada por mecanismos apoptóticos. Su administración "in vivo" tiene efecto antitumoral, antiangiogénico y protector contra tumores malignos.

Composición farmacéutica antitumoral que contiene fragmentos polipeptídicos de serralisinas

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología, la industria farmacéutica y, en concreto, con la producción de una composición capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales. Esta composición contiene fragmentos polipeptídicos de serralisinas, obtenidos de la degradación de la proteína intacta, que tienen una actividad antiproliferativa mayor que la de las moléculas enteras de serralisina. Dichos fragmentos pertenecen al extremo C de las serralisinas, desde la metionina interna de la secuencia de la serralisina al final de la molécula, y la combinación de los mismos con prodigiosinas que potencial el efecto antitumoral de esta composición.

Técnica anterior

Tradicionalmente, la quimioterapia para el cáncer se ha dirigido a la inhibición de la proliferación de las células cancerosas. No obstante, en los últimos años, el interés de los productos antitumorales que inducen la apoptosis ha aumentado porque el cáncer se ha establecido como patología relacionada con una deficiencia relativa en la apoptosis, en lugar de un exceso de la proliferación.

Las bacterias o sus extractos se han usado para el tratamiento del cáncer durante casi 100 años. El informe más citado procede del médico y cirujano William B. Coley del Memorial Hospital in New York city, el Sloan-Kettering Memorial Hospital. Ha observado que muchos de estos pacientes con varios tipos de cáncer experimentan regresión tumoral tras ser infectados con bacterias patogénicas. (Coley, W. B. 1991-reimpreso de 1893-. Clin. Orthop. 262:3) .

La resistencia a los tumores en pacientes o animales infectados se atribuyó a la inmunidad antitumoral celular concomitante (Paglia, P. y Guzmán, C. A. 1998. Cáncer immunol. Immunother. 46:88) . Recientemente, Hunter y col. ha cuestionado la idea de que la infección por bacterias patogénicas o protozoos podría activar la regresión del cáncer mediante la activación de la inmunidad innata o adaptativa. (Hunter, C. A., Yu, D., Gee, M., Ngo, C. V., Sevignani, C., Goldschmidt, M., Golovkina, T. V., Evans, S., Lee, W. F. y Thomas-Tekhonenko, A. 2001. J. Immunol. 166:5878) . Demostraron que los tejidos infectados por T. Gondii producen algunos factores antiangiogénicos solubles que evitan la formación de vasos sanguíneos en los tumores, lo que podría ser de potencial interés terapéutico. Este proceso de formación de nuevos capilares conocido como angiogénesis se ha convertido en un foco de atención importante para la implementación de nuevas terapias para el cáncer y sus metástasis. La búsqueda de factores antiangiogénicos es la base de nuevas estrategias terapéuticas anticancerosas (Folkman, J. 2003. Seminars in Cáncer Biology. 13:159) . Recientemente, el uso de bacterias como agentes quimioterapéuticos y agentes antivasculares selectivos ha tenido como resultado una regresión significativa de tumores subcutáneos (sc) en ratones. Este tratamiento se denomina terapia bacteriolítica combinada (COBALTO) (Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D.L., Klnzler, K.W. y Vogelstein, B. 2001. Proc Natl Arad Sci USA. 98: 15155) . No obstante, las bacterias vivas producen una toxicidad importante y reacciones colaterales que limitan su uso contra el cáncer humano.

En los últimos años han aparecido algunos informes que indican que las bacterias anaerobias liberan proteínas redox que inducen la apoptosis de células tumorales ( (Yamada, T., Goto, M., Punj, V., Zaborina, O. y Chen, M.L. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 14088; Goto, M., Yamada, T., Kimbara, K., Horner, J., Newcomb, M., Gupta,

T.K. and Chakrabarty, A. M. 2003. Mol Microbiol. 47:549) . Se ha postulado que estas proteínas redox podrían estar incluidas en un grupo de proteínas solubles secretadas por los ancestros de las células procariotas y sus funciones podían haber sido la eliminación de células eucariotas ancestrales (Punj, V. y Chakrabarty, A. M. 2003. Cellular Microbiology. 5:225) . En general se sabe poco sobre la producción de factores solubles secretados por estos organismos procariotas que podrían actuar de un modo específico sobre las células cancerosas, produciendo su muerte y, de forma concomitante, la regresión del tumor.

Serratia marcescens es una bacteria anaerobia facultativa. A partir de algunas de sus cepas se han obtenido algunas preparaciones con propiedades antitumorales, las más estudiadas son: [a] ImuVert® (Budagov, R.S. y Ulianova, L.P. 2001. Radiats Biol Radioecol Russian. 41:38) , una preparación de membranas ribosomales que activan el sistema inmunitario del paciente; [b] la proteasa de Serratia Mr 56, 000 (Wu, J., Akaike, T., Hayashida, K., Okamoto, T., Okuyama, A. and Maeda, H. 2001. Jpn. J. Cáncer Res. 92:439) , que induce la muerte de las células por necrosis dependiendo de la expresión de la a-2-macroglobulina; y [c] las prodigiosinas, una familia de pigmentos que actúan como inmunosupresores y anticancerígenos a través de la inducción de la apoptosis (Montaner, B y Pérez Tomas, R. 2003. Curr Cáncer Drug Targets. 3:57; Pérez Tomas, R. y Montaner, B. 2003. Histol Histopathol. 18:379) .

Los autores han obtenido fragmentos no proteolíticos de las serralisinas con mayor actividad citotóxica que las moléculas enteras. Esto permite la combinación de estos fragmentos con dosis bajas de prodigiosina, disminuyendo la toxicidad indicada para el pigmento e incrementando el efecto antiproliferativo sobre las células tumorales.

Descripción detallada de la invención

Las composiciones de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales y están formadas por fragmentos polipeptídicos de las serralisinas, con un efecto antiproliferativo mayor que las moléculas de serralisinas enteras, que pueden combinarse con prodigiosinas que potencian su efecto antitumoral.

La presente invención describe la composición de la preparación MG2327, en la que coexisten los polipéptidos y las prodigiosinas, que tienen un amplio espectro de actividad citotóxica sobre las líneas celulares malignas, con un efecto selectivo sobre las células tumorales transformadas y, específicamente, sobre las células activadas para su crecimiento. El estudio de sensibilidad sobre diferentes líneas celulares, tumorales o no, demuestra que las líneas celulares normales son solo ligeramente sensibles a la preparación MG2327, mientras que las células derivadas de melanoma, carcinoma laríngeo, fibrosarcoma, hepatocarcinoma y carcinoma uterino-cervical (positivos o no para el virus del papiloma humano) son muy sensibles. Los carcinomas de origen hematopoyético son menos sensibles. Las células HUVEC activadas para su crecimiento son más sensibles a la preparación MG2327 que las no activadas. La preparación MG2327 puede actuar específicamente sobre factores expresados o sobreexpresados durante el proceso de la división celular. Estos factores constituyen dianas terapéuticas contra el cáncer u otras enfermedades de origen proliferativo. Además, estos factores también constituyen dianas para el diagnóstico precoz de enfermedades originadas por un exceso de proliferación o por la proliferación no controlada de células diferenciadas

o no diferenciadas. Las formulaciones de liberación controlada que contienen estas moléculas podrían dirigirse a estas dianas en proliferación que actúan de un modo específico sobre ellas; ya que las células normales son más resistentes a su acción.

Con el fin de demostrar la actividad antitumoral de la preparación MG2327, se expuso a ratones BALB/c a una inoculación intraperitoneal de células tumorales CB Hep.1 de origen mieloide capaces de producir tumores murinos ascíticos (Fontirrochi, G., Dueñas, M., Fernandez de Cossio, M.E., Fuentes, P., Pérez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30) . Tras 10 días se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal la preparación MG2327 o PBS. El 60 % de los animales tratados con 1 mg/kg sobrevivió, mientras que solo el 25 % de los controles estaba vivo 45 días después de comenzado el tratamiento (Fig. 8) . La regresión tumoral total se observó en los supervivientes tratados, que mostraban un estado saludable, mientras que en los controles, los tumores progresaron hasta formar masas sólidas grandes y los ratones mostraron un deterioro del estado de salud general.

Los ratones BALB/c portadores de tumores de origen mieloide tratados con una dosis de... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica caracterizada porque contiene uno o varios fragmentos de serralisina que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 16, para uso en la inducción de efectos anti-tumorales en el organismo receptor y dichos efectos antitumorales son, terapéuticos o preventivos.

2. Una composlclón farmacéutica para uso acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos fragmentos de serralisina se obtieben de sobrenadantes de cultivos celulares mediante manipulación genética o mediante síntesis química.

3. Una composición para uso acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en la que dichos fragmentos aparecen en la composición solos, conjugados o mezclados,

4. Una composición para uso acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dichos fragmentos de serralisina son parte de moléculas quiméricas o híbridas obtenidas mediante manipulación genética o mediante síntesis química.

5. Fragmentos de serralisina seleccionados del grupo constituido por las SEC ID Nº 1-4 y las SEC ID Nº 10-16 para uso en el tratamiento de enfermedades proliferativas.

6. Fragmentos de serralisina para usar de acuerdo con la reivindicación 5, en los que dichos fragmentos son parte de una composición que contiene anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hebras de ácido nucleico o moléculas de hidratos de carbono o moléculas de proteínas y dichos fragmentos están solos, conjugados o mezclados.

7. Fragmentos de serralisina para usar de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, solos o en combinación, que se caracterizan porque forman parte de dicha composición como agregados moleculares, solos, en combinación entre ellos o en combinación con otras moléculas de hidratos de carbono o moléculas de proteínas.

8. Un procedimiento de diagnóstico in vitro para patologías relacionadas con la sobreexpresión de receptores para factores de crecimiento y enfermedades inflamatorias que comprenden el uso de fragmentos de serralisina de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 7, solos o en combinación,

9. Un procedimiento de detección selectiva para patologías relacionadas con la sobreexpresión de receptores para factores de crecimiento y enfermedades inflamatorias, que comprende el uso de fragmentos de serralisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, solos o en combinación,

10. Una composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque además contiene una o más prodigiosinas, en la que dichas prodigiosinas potencian la actividad antitumoral de la composición mencionada,

11. Una composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 10 para usar en el tratamiento de estados patológicos relacionados con la angiogénesis, células en proliferación y sistema inmunitario.

12. Una composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 10 para usar en el tratamiento de estados patológicos que se pueden tratar mediante inducción de factores antiproliferativos, apoptóticos, antiangiogénicos, inmunomoduladores o de diferenciación/regulación.

Proteína

Tratados

FIG. 11

FIG. 13

FIG. 15

FIG. 16