Componente de bromelina.

Una fracción aislada de bromelina que comprende una proteína de peso molecular de aproximadamente27,

45 kDa tal como se determina mediante SDS-PAGE, un punto isoeléctrico de 9,7 tal como se determinamediante enfoque isoeléctrico y una secuencia de aminoácidos N-terminal Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp TrpArg Gln Lys Gly Ala Val Thr Glu Val Lys Asn Arg Gly, fracción de bromelina que puede obtenerse medianteel método siguiente:

i. disolver la bromelina en tampón acetato 20 mM a pH 5,0 que contiene EDTA sódico 0,1 mM;

ii. separar los componentes de la bromelina mediante cromatografía líquida para la separación rápida deproteínas en SP-Sepharose HP, eluyendo con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 0,8 M entampón acetato sobre 300 ml; y

iii. recoger la fracción correspondiente al tercer pico que se obtiene de la columna, que aparece en el bordeascendente del primer pico principal de proteasa de la bromelina de tallo.

Componente de bromelina La presente invención se refiere a una fracción de bromelina. En particular, la invención se refiere a una fracción de bromelina que comprende una proteína novedosa y que tiene actividad inmunomoduladora y antitumoral.

La bromelina de tallo (bromelina) es el nombre colectivo para las enzimas proteolíticas encontradas en los tejidos de la planta Bromeliaceae. Es una mezcla de diversos restos derivados del tallo de la planta de la piña (Ananas comosus) . Se sabe que la bromelina contiene al menos cinco enzimas proteolíticas pero también enzimas no proteolíticas, incluyendo una fosfatasa ácida y una peroxidasa; también puede contener actividad amilasa y celulasa. Además, están presentes otros componentes diversos.

La bromelina se ha usado anteriormente en el tratamiento de una variedad de estados incluyendo inflamación y, en particular, se ha usado en el tratamiento de la diarrea. El uso de bromelina en el tratamiento de la diarrea infecciosa se describe en el documento WO-A-9301800, en el que se sugiere que la bromelina funciona destruyendo los receptores intestinales para los patógenos mediante proteolisis, y en el documento WO-A-8801506, que enseña que la bromelina separa a los patógenos de los receptores intestinales.

Taussig et al, Planta Medica, 1985, 538-539 y Maurer et al, Planta Medica, 1988, 377-381 sugieren ambos que la bromelina puede ser de utilidad en la inhibición del crecimiento tumoral. Los documentos US 5.223.406, DE-A4302060 y JP-A-59225122 también enseñan el uso de bromelina en el tratamiento del cáncer. El documento US

5.223.406 enseña que la bromelina puede inducir el factor de necrosis tumoral (TNF) mientras que el documento DE-A4302060 enseña que la bromelina puede evitar la metástasis mediante la modificación estructural de la proteína de la superficie tumoral CD44.

En el documento WO-A-9400147, se describieron diversos experimentos que demuestran que las enzimas proteolíticas y, en particular, la bromelina, pueden inhibir la secreción. La solicitud también describe que la bromelina puede reducir la actividad de unión a toxinas y puede inhibir el efecto secretor de toxinas, tales como la toxina termolábil (TL) y la toxina colérica (TC) y también toxinas tales como la toxina termoestable (TE) . Esto es a pesar del hecho de que la TE tiene un modo muy diferente de acción de TL y TC. Estas observaciones se explicaron mediante el hecho de que un componente de la mezcla de bromelina, la proteasa de bromelina de tallo, parece poder modular las rutas nucleotídicas cíclicas y esto se trata adicionalmente en el documento WO-A-9500169. Además, también se ha demostrado que la bromelina inhibe la secreción producida por la ruta dependiente del calcio.

El documento WO-A-9600082 también se refiere a la bromelina y describe que la bromelina bruta puede interferir con las rutas de señalización que son importantes para el crecimiento, en particular, las rutas de señalización que conducen a la producción de factores de crecimiento tales como la interleucina 2 (IL-2) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) . Este documento enseña que, como consecuencia de su capacidad para bloquear las rutas de señalización, la bromelina puede actuar como un agente anticancerígeno. Además, la bromelina puede usarse o bien como un agente inmunosupresor o bien como un inmunoestimulante, dependiendo del tipo de célula que se esté tratando y de si la célula se ha activado anteriormente.

A partir de la técnica anterior, está claro que la bromelina es una mezcla que tiene una variedad de diferentes efectos fisiológicos. No se han caracterizado todos los componentes de la mezcla de bromelina y, por tanto, a excepción de la proteasa de bromelina de tallo, cuya actividad se ha descrito, no está claro cuál de los componentes es responsable de cuál de los diversos efectos diferentes de la bromelina. Naturalmente, esto es una desventaja principal si la mezcla de bromelina va a administrarse como un producto farmacéutico porque mientras que un componente de bromelina podría facilitar el efecto deseado, podría haber también efectos secundarios no deseados que surgen de la acción de algún otro componente de la mezcla de bromelina.

Por tanto, sería beneficioso si pudieran aislarse los componentes individuales de bromelina que dan lugar a actividades medicinales particulares y administrarse por separado de manera que se redujera la posibilidad de efectos secundarios.

La presente invención se refiere a una fracción particular que se ha aislado de la mezcla de bromelina y que parece ser, al menos parcialmente, responsable de la actividad inmunomoduladora y anticancerígena.

La fracción de la invención puede aislarse de la mezcla de bromelina mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante cromatografía. La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) es adecuada para el fin y puede lograrse una separación particularmente buena de las proteínas de la bromelina mediante la cromatografía líquida para la separación rápida de proteínas (FPLCTM) usando un material de empaquetamiento de columna tal como SP-Sepharose. Tal como se describirá en más detalle en los ejemplos, en la cromatografía sobre SP-Sepharose usando un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 0, 8 M en tampón acetato sobre 300 ml, la proteína de la presente invención fue el tercer pico que se obtiene de la columna, apareciendo en el borde ascendente del primer pico principal de proteasa de la bromelina de tallo (el cuarto pico que se obtiene de la columna) .

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una fracción de bromelina tal como se explica en la reivindicación 1. La fracción tiene un peso molecular de aproximadamente 27, 45 kDa, tal como se determina mediante SDS-PAGE, y puede obtenerse mediante el método siguiente:

i. disolver la bromelina en tampón acetato a pH 5, 0;

ii. separar los componentes de la bromelina mediante cromatografía líquida para la separación rápida de proteínas de alta resolución en SP-Sepharose eluyendo con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 0, 8 M en tampón acetato sobre 300 ml;

iii. recoger la fracción correspondiente al tercer pico que se obtiene de la columna, que aparece en el borde ascendente del primer pico principal de proteasa de la bromelina de tallo (el cuarto pico que se obtiene de la columna) ; y

iv. aislar la proteína de la fracción recogida en (iii) .

La fracción de bromelina de la presente invención, denominada CCZ por los inventores, es responsable en gran medida de la actividad inmunoestimulante de la bromelina, ya que se ha encontrado que otros componentes conocidos tales como la proteasa de la bromelina de tallo (SBP) , la comosaína y la ananaína tienen actividad inmunoestimulante insignificante y, de hecho, pueden actuar como inmunosupresores. Los inventores han encontrado que una fracción de bromelina denominada CCU por los presentes inventores tiene cierta actividad inmunomoduladora ya que tiene F9, que también está contenida en la bromelina (Garbin et al, Int. J. of Oncology, (1994) 5, 197-203) .

Además, debido a que tiene un número mucho menor de componentes que la bromelina bruta, no es probable que la fracción de bromelina de la invención tenga tantos efectos secundarios cuando se usa como agente farmacéutico y su actividad puede definirse más claramente.

Los presentes inventores han caracterizado y obtenido la secuencia de aminoácidos del principal componente de la fracción CCZ. Se cree que esta proteína es responsable de la actividad biológica de la fracción CCZ.

Por tanto, en el presente documento se describe una proteína que es un componente de bromelina, tiene un peso molecular de aproximadamente 27, 45 kDa tal como se determina mediante SDS-PAGE, tiene un punto isoeléctrico de 9, 7 tal como se determina mediante enfoque isoeléctrico y tiene la secuencia amino terminal.

Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys Gly Ala Val Thr Glu Val Lys Asn Arg Gly

La fracción CCZ de la presente invención puede actuar como un agente inmunoestimulante y como un agente anticancerígeno y se cree que la proteína del segundo aspecto puede ser responsable de estas actividades. Por ejemplo, se sabe a partir del documento WO-A-9301800, que la mezcla de bromelina es un agente inmunoestimulante no específico, pero anteriormente se había supuesto que uno de los componentes conocidos de la bromelina, probablemente la proteasa de la bromelina de tallo, era responsable de esta actividad. Ahora se ha encontrado que éste no es el caso y que la proteína de la presente invención es un agente inmunoestimulante, mientras que... [Seguir leyendo]

1. Una fracción aislada de bromelina que comprende una proteína de peso molecular de aproximadamente 27, 45 kDa tal como se determina mediante SDS-PAGE, un punto isoeléctrico de 9, 7 tal como se determina mediante enfoque isoeléctrico y una secuencia de aminoácidos N-terminal Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp

Arg Gln Lys Gly Ala Val Thr Glu Val Lys Asn Arg Gly, fracción de bromelina que puede obtenerse mediante el método siguiente:

i. disolver la bromelina en tampón acetato 20 mM a pH 5, 0 que contiene EDTA sódico 0, 1 mM;

ii. separar los componentes de la bromelina mediante cromatografía líquida para la separación rápida de proteínas en SP-Sepharose HP, eluyendo con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 0, 8 M en 10 tampón acetato sobre 300 ml; y

iii. recoger la fracción correspondiente al tercer pico que se obtiene de la columna, que aparece en el borde ascendente del primer pico principal de proteasa de la bromelina de tallo.

2. La fracción de bromelina según la reivindicación 1, para su uso en la medicina humana o veterinaria.

3. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de una

inmunodeficiencia primaria o inmunodeficiencia secundaria que resulta de desnutrición, infección, tumores, traumatismos, tratamiento médico con fármacos, pérdida de proteínas, diabetes y vejez.

4. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 1, para su uso como adyuvante de vacuna.

5. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, para estimular la inmunidad innata.

6. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, para estimular la inmunidad adaptativa.

7. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de una infección microbiana.

8. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de un cáncer.

9. La fracción aislada de bromelina según la reivindicación 8, en la que el cáncer es cáncer de ovario, mama, colon o pulmón, melanoma, leucemia o linfoma.

10. Una composición farmacéutica o veterinaria que comprende la fracción de bromelina según la reivindicación 1, junto con un excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

11. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 10, que es inmunoestimulante. 30 12. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 11, que estimula la inmunidad innata.

13. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 11, que estimula la inmunidad adaptativa.

14. La composición farmacéutica o veterinaria según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que está formulada para la administración oral, enteral, nasal, bucal o anal.

15. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 14, que está formulada para la 35 administración enteral, nasal, bucal o anal.

16. La composición farmacéutica o veterinaria según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que está formulada para la administración parenteral.

17. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 16, en la que la administración parenteral es mediante una vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal.

18. Una composición de vacuna que comprende una vacuna, un adyuvante que comprende la fracción de bromelina según la reivindicación 1, junto con un excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

19. La composición de vacuna según la reivindicación 18, que está formulada para la administración oral, enteral, nasal, bucal o anal.

20. La composición de vacuna según la reivindicación 18, que está formulada para la administración parenteral.

21. La composición de vacuna según la reivindicación 20, en la que la administración parenteral es mediante una vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal.

22. La composición de vacuna según una cualquiera o las reivindicaciones 18 a 21, que estimula la inmunidad innata.

23. La composición de vacuna según una cualquiera o las reivindicaciones 18 a 21, que estimula la inmunidad adaptativa.