COMPLEJOS DE METAL DE TRANSICIÓN MARCADOS.

Complejo de metal de transición marcado, que comprende un átomo de metal de transición,

un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador, en el que el átomo de metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos donadores, seleccionándose cada uno independientemente entre el grupo de átomos de nitrógeno y azufre, átomos donadores que están presentes en el resto tridentado y en el que los átomos donadores en el resto tridentado están separados entre sí por 3-5 átomos de carbono

La presente invención se refiere a complejos de metal de transición marcados, entidades químicas o biológicas marcadas, que comprenden dichos complejos, métodos para preparar dichas entidades químicas o biológicas marcadas, así como a utilizaciones específicas de dichos complejos de metal de transición.

El marcado de moléculas bio-orgánicas, tales como moléculas de ADN, es deseable para aplicaciones en campos tales como tecnología de ADN recombinante. En muchos casos, sin embargo, no se desea marcar la macromolécula de ácido nucleico, sino marcar cierto nucleótido. El objetivo principal del marcado de nucleótidos es que estos nucleótidos marcados puedan incorporarse en moléculas de ácido nucleico. De esta manera, puede influirse sobre la ubicación del marcador en el ácido polinucleico resultante, lo que no es posible cuando se une un marcador a la macromolécula.

Se sabe que los nucleótidos pueden unirse de manera suficiente a un marcador por medio de un complejo de cis-platino. Sin embargo, dichos nucleótidos marcados no son incorporados de forma satisfactoria para formar moléculas de ADN por la ADN polimerasa, o no lo son en absoluto.

Los métodos alternativos disponibles para marcar un nucleótido, que puede incorporarse en un ácido polinucleico son los métodos más convencionales de marcado. Sin embargo, estos métodos también tienen una gran desventaja, ya que no son adecuados para marcar cualquier nucleótido. En algunos casos, por ejemplo, cuando solamente unos pocos residuos de cierto nucleótido están presentes en cierto ácido polinucleico, o cuando se va a marcar el residuo nucleotídico terminal de un ácido polinucleico, se desea ser capaz de marcar cualquier nucleótido. Un ejemplo de dicho método convencional ha sido descrito por Dale y otros, Biochemistry, 14, (1975), 2447-2457, método que implica mercuriación covalente directa como técnica de marcado. Dale y otros, describen que la citosina y el uracilo pueden mercuriarse en su posición C5 en condiciones suaves. Sin embargo, también describen que, para las bases adenina, timina y guanina, se obtuvieron resultados negativos.

Por lo tanto, existe una necesidad de un sistema de marcado universal, que sea excelente para unir marcadores y moléculas bio-orgánicas, incluyendo todos los nucleótidos diferentes, y que también haga posible incorporar enzimáticamente cualquier nucleótido marcado a través de dicho sistema de marcado en un ácido polinucleico de manera eficaz.

Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva categoría de complejos de metal de transición que pueden marcar a una entidad química o biológica de forma, como mínimo, tan eficaz como los métodos conocidos. Además, se concibe que los nucleótidos unidos al sistema de marcado de la presente invención puedan incorporarse en polinucleótidos muy eficazmente.

Estos complejos de metal de transición marcados comprenden un resto tridentado inerte como puente estabilizador, un marcador, y un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo del metal de transición.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un complejo de metal de transición marcado que comprende un átomo de metal de transición, un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador, según la reivindicación 1.

Estos complejos de metal de transición pueden prepararse con mayores rendimientos que los que se basan en restos bidentados, mientras que muestran además estabilidades y purezas mejoradas. Además, los presentes complejos metálicos son más reactivos y provocan un marcado más eficaz en comparación con complejos de metal de transición que se basan en restos bidentados. Además, la preparación de un complejo de metal de transición según la presente invención puede realizarse en un procedimiento de una etapa, lo que es altamente ventajoso.

Entre las ventajas de la utilización de ligandos tridentados están el efecto de quelado y el efecto trans. El efecto de quelado se refiere a la coordinación más rápida y más eficaz de un átomo de metal de transición con el ligando, debido a que el metal se une a tres sitios de una y la misma molécula. Como resultado, la pureza a la que se obtiene el complejo es mayor. El efecto trans se refiere a las mayores reactividad y eficacia de marcado de un complejo de metal de transición según la presente invención, debido a que los grupos salientes están situados en la posición trans de un sitio de unión del resto tridentado, otorgando un carácter polar a la configuración. Este sitio de unión es, preferentemente, una amina secundaria o terciaria, contribuyendo de este modo a dicho carácter polar.

Casi cualquier entidad química o biológica que contiene un átomo de S (azufre) o átomo de N (nitrógeno) accesible puede marcarse con los complejos de metal de transición marcados según la presente invención. Las entidades adecuadas para ser marcadas con los complejos de metal de transición marcados son moléculas bio-orgánicas tales como ácido nucleico (nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ADN, ARN, homodúplex, heterodúplex o múltiplex).

Los complejos de metal de transición se unen muy fácilmente (de forma no covalente) a la posición N-7 de residuos de guanina. De esta manera, moléculas de ADN o ARN, ya sean monocatenarias o no, pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, detectarse, separarse, purificarse, aislarse), pero esto también permite la producción de sondas para técnicas de hibridación en las que moléculas de ADN/ARN no marcadas hibridan con la sonda marcada. Los complejos de metal de transición marcados apenas interfieren en la hibridación, si es que interfieren. Además, esta técnica evita la utilización de nucleótidos modificados en la preparación de sondas. Sin embargo, proteínas, péptidos y otras moléculas bio-orgánicas también pueden identificarse con las sustancias de marcado según la presente invención.

Los complejos de metal de transición marcados según la presente invención también son muy adecuados para unir moléculas bio-orgánicas a superficies sólidas tales como nitrocelulosa, filtros de nylon, placas de microvaloración, perlas, vidrio, fibras y similares.

Nucleótidos modificados utilizando un complejo de metal de transición según la presente invención y oligonucleótidos y polinucleótidos en los que los nucleótidos se han incorporado, y oligonucleótidos y polinucleótidos que se han modificado directamente utilizando estos nuevos compuestos de platino pueden utilizarse como sondas en investigación biomédica, diagnóstico clínico y tecnología de ADN recombinante.

La amplia diversidad de utilidades de los complejos según la presente invención se basa en la capacidad de los complejos de metal de transición para formar complejos estables con moléculas bio-orgánicas, por ejemplo ácidos (poli)nucleicos o (poli)péptidos y derivados de los mismos que, a su vez, podrían detectarse por medio de restos detectables que están unidos a moléculas bio-orgánicas o interactúan con las mismas. Algunas utilizaciones incluyen detectar e identificar agentes etiológicos que contienen ácido nucleico, por ejemplo bacterias y virus; cribar bacterias en busca de resistencia a antibióticos; cribar animales en busca de trastornos genéticos relacionados con efectos farmacéuticos; diagnosticar trastornos genéticos, por ejemplo trisomía del par 21, anemia de células falciformes: cariotipado cromosómico; e identificar células tumorales. Además, los complejos de marcado son muy útiles en farmacología, especialmente para el cribado de fármacos, identificación de dianas de fármacos, monitorización de fármacos y administración de fármacos.

La presente invención también da a conocer un kit de diagnóstico para identificar, determinar y/o localizar sustancias biológicas de interés, que comprende el complejo de metal de transición de la presente invención, opcionalmente junto con otros medios adecuados para la detección. Por supuesto, la presente invención también da a conocer un kit, en el que los respectivos componentes del complejo de metal de transición marcado están presentes por separado, es decir, en forma no unida.

Los ejemplos de complejos de metal de transición adecuados según la presente invención son complejos en los que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende... [Seguir leyendo]

1. Complejo de metal de transición marcado, que comprende un átomo de metal de transición, un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador,

en el que el átomo de metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos donadores, seleccionándose cada uno independientemente entre el grupo de átomos de nitrógeno y azufre, átomos donadores que están presentes en el resto tridentado y en el que los átomos donadores en el resto tridentado están separados entre sí por 3-5 átomos de carbono.

2. Complejo, según la reivindicación 1, en el que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende vanadio, cromo, hierro, níquel, cobre, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno, cobalto, manganeso, osmio, rodio, iridio, zinc y cadmio.

3. Complejo, según la reivindicación 2, en el que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende hierro, níquel, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno y cobalto.

4. Complejo, según la reivindicación 3, en el que el metal de transición es platino, cobalto o rutenio.

5. Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el marcador está contenido en el resto tridentado o unido al resto tridentado, opcionalmente por medio de un espaciador.

6. Complejo, según la reivindicación 5, en el que el átomo del metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos de nitrógeno.

7. Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el marcador es una marca fluorescente.

8. Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el resto reactivo se selecciona entre el grupo que comprende Cl -, NO3-, HCO3-, CO32-, SO32-, ZSO3-, I -, Br -, F -, acetato, carboxilato, fosfato, nitrato de etilo, oxalato, citrato, un fosfonato, ZO, y agua, en el que Z se define como un resto de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.

9. Entidad química o biológica marcada que comprende una entidad química o biológica que está unida a un complejo de metal de transición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la entidad química o biológica ha sustituido al resto reactivo.

10. Entidad química o biológica marcada, según la reivindicación 9, en la que la entidad se selecciona entre el grupo que comprende aminoácidos, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, inmunoglobulinas, enzimas, sinzimas, fosfolípidos, glucoproteínas, ácidos nucleicos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos péptidonucleicos, oligómeros de ácidos péptidonucleicos, polímeros de ácidos péptidonucleicos, aminas y aminoglucósidos.

11. Método para preparar una entidad química o biológica marcada, según la reivindicación 9 ó 10, en el que una entidad química o biológica se pone en contacto con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en condiciones tales que el resto reactivo es sustituido por la entidad química o biológica.

12. Utilización de un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para crear un cambio definido del peso molecular de la entidad química o biológica para facilitar el análisis por espectrometría de masas de dicha entidad o una muestra que comprende dicha entidad.

13. Método para hacer a una entidad química o biológica distinguible mediante espectrometría de masas, comprendiendo dicho método la etapa de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

14. Método para análisis por espectrometría de masas de una entidad química o biológica, comprendiendo dicho método las etapas de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y analizar dicha entidad mediante espectrometría de masas.

15. Método, según la reivindicación 13 ó 14, en el que se marcan, como mínimo, dos entidades y en el que dichas entidades proceden de diferentes muestras.

16. Método, según la reivindicación 15, en el que dicha etapa de marcar de forma diferencial a dicha entidad se realiza, como mínimo, con dos complejos de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dichos complejos de metal de transición son de diferente peso molecular, siendo dicha diferencia de peso molecular ≥ 1 Da.

17. Conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente peso molecular, en el que cada uno de dichos complejos de metal de transición es según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

5 18. Kit de partes que comprende el conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente peso molecular, según la reivindicación 17.

19. Kit de partes, según la reivindicación 18, que comprende además, como mínimo, un artículo seleccionado entre

el grupo que comprende instrucciones de reacción, muestras de ensayo, tubos o tiras de ensayo, tampones, 10 preparaciones de marcador y preparaciones para ajustar la fuerza iónica.