Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral.

Inmunoensayo, según el concepto de puente de doble antígeno, que comprende:

un primer antígeno quecomprende un primer complejo chaperona-antígeno y un segundo antígeno que comprende un segundo complejochaperona-antígeno, en el que dichos antígenos son proteínas amiloidogénicas y en el que dichas chaperonas sonseleccionadas del grupo que consiste en SlyD y FkpA.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10173342.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: FAATZ, ELKE, ANDRES, HERBERT, ENGEL, ALFRED, SCHOLZ, CHRISTIAN, SIZMANN,Dorothea.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/543 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos.
  • G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.

PDF original: ES-2391623_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral

La presente invención se refiere al diagnóstico de infecciónes por VIH. Específicamente describe la producción de un complejo soluble de glicoproteína de superficie (o glicoproteína transmembrana) retroviral-chaperona, y la utilización ventajosa de un complejo chaperona-antígeno, especialmente en la detección de anticuerpos VIH en inmunoensayos, preferentemente, según el concepto de puente de doble antígeno. La invención da a conocer también complejos solubles que comprenden una variante de VIH-1 gp41 o una variante de VIH-2 gp36, respectivamente, y una chaperona (acompañante) seleccionado del grupo que consiste en SlyD y FkpA. También se describen variantes que comprenden sustituciones de aminoácidos específicos del dominio N-helicoidal de VIH-1 gp41 o de VIH-2 gp36, respectivamente.

Antecedentes

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es el agente del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida, denominado habitualmente por su acrónimo SIDA. Existen dos cepas principales del virus, denominadas VIH-1 y VIH-2. El virus de la IH se halla en la actualidad ampliamente diseminado y constituye una amenaza grave contra la salud y bienestar en todo el mundo, obliga a los sistemas de atención sanitaria públicos a gastar grandes sumas de dinero en el diagnóstico del VIH y el tratamiento del SIDA.

Una de las vías de diseminación del virus es la transfusión de sangre o derivados sanguíneos infectados. Prácticamente todos los países industrializados, así como muchos países en vías de desarrollo, requieren actualmente de forma obligatoria el análisis de todas las donaciones de sangre para evitar una mayor diseminación del virus. Es tarea de todos los métodos diagnósticos en este campo diagnosticar la infección por VIH de la sangre de forma lo más fiable y temprana posible después de la infección.

Básicamente, se dispone de tres modos de diagnóstico diferentes:

(1) diagnóstico de material genómico viral en sangre mediante procedimientos de diagnóstico de ácidos nucleicos sensibles como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ,

(2) detección de antígenos virales en sangre, y

(3) detección de anticuerpos contra el VIH en fluidos corporales.

Durante el curso de la infección por el VIH, se conocen varias fases diagnósticas distintas y relevantes. En una fase temprana de la infección solamente se hallaron proteínas y péptidos derivados del virus de la IH (fase virémica) , no detectándose todavía anticuerpos anti-VIH. En la fase siguiente, que se denomina seroconversión, aparecen anticuerpos contra el VIH, disminuyendo la cantidad de antígenos virales (carga viral) . La mayoría de los anticuerpos formados en la fase inicial de la seroconversión pertenecen a la clase M (IgM) de las inmunoglobulinas. Más tarde, la respuesta inmune contra el VIH cambia a las inmunoglobulinas de la clase G (IgG) , que constituyen entonces la mayoría de los anticuerpos dirigidos contra el VIH. Durante la evolución ulterior de la infección, el nivel de anticuerpos anti-VIH puede disminuir mientras que la carga viral (la presencia de partículas virales o antígenos virales) en los fluidos corporales puede aumentar de nuevo. El cribado de la presencia de infección por VIH se realiza preferentemente mediante ensayos serológicos que detectan anticuerpos contra antígenos del VIH, en ocasiones combinados con la detección del antígeno VIH. Dado que la respuesta inmune en un paciente concreto cambia durante el curso de la infección y también varía de una paciente a otro, es importante poseer inmunoensayos extremadamente sensibles y fiables que detecten anticuerpos anti-VIH pertenecientes a las subclases IgM e IgG. Se han descrito diversos enfoques diferentes para la detección de la infección por VIH. Es crucial y de mayor importancia la detección precoz, fiable y sensible de anticuerpos contra las proteínas virales.

Las proteínas virales, que frecuentemente se denominan antígenos virales, pueden ser detectables solamente en el momento de producirse la infección y en etapas muy tardías de la enfermedad. Por tanto, los ensayos para la detección de antígenos virales, como los ensayos que miden p24 (para el VIH-1) o p26 (para el VIH-2) , que son proteínas virales del núcleo, solamente pueden utilizarse en combinación con otros medios diagnósticos para detectar de forma fiable la infección por VIH.

Teóricamente se dispone de tres grupos de antígenos virales, que pueden inducir la formación de anticuerpos en el huésped, y que por lo tanto, pueden utilizarse como antígenos en los procedimientos diagnósticos. Estos son las proteínas de la envoltura viral (codificadas por la región génica env) , enzimas virales o proteínas reguladoras tales como la transcriptasa inversa o la integrasa (codificadas por la región génica pol) y proteínas estructurales del núcleo (codificadas por la región génica gag) . Las proteínas de la envoltura viral son tanto en el VIH-1 como en el VIH-2 glicoproteínas que se sintetizan como polipéptidos precursores de las proteínas (gp 160 para VIH y gp 140 para VIH-2) . Estos precursores de alto peso molecular, tras su síntesis, son escindidos respectivamente en gp120 y gp41 (VIH-1) o gp110 y gp36 (VIH-2) . Los polipéptidos más grandes (gp120 o gp110, respectivamente) forman una subunidad de superficie que se asocia a polipéptidos más pequeños que abarcan la membrana (gp41 y gp36, respectivamente) a través de contactos holgados. En muchos huéspedes (pacientes) , las proteínas de la envoltura son las dianas preferentes de la respuesta inmune anti-viral. Ratner, L., y otros, Nature 313 (1985) 277-84, han demostrado que especialmente las proteínas que abarcan la membrana de estas proteínas de la envoltura, es decir, gp41 o gp36, respectivamente, poseen el mayor potencial inmunogénico entre estas proteínas virales.

Los métodos de inmunoensayo, tales como, por ejemplo, el ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) , que utilizan polipéptidos codificados por el virus de la IH, se han utilizado ampliamente en el diagnóstico y cribado. Los polipéptidos virales se preparan bien directamente, o se derivan a partir de sistemas de expresión in vitro o in vivo utilizando tecnología de ADN recombinante. Ambos modos de producción de antígenos presentan limitaciones importantes. Los polipéptidos derivados a partir de preparaciones virales pueden estar contaminados con virus viables o material genético infeccioso, suponiendo, por tanto, un riesgo para el personal que utiliza el material. El material derivado de forma recombinante puede estar contaminado por proteínas no VIH del huésped, lo que puede dar lugar a una reducción de la especificidad o especificidad de dichos ensayos.

En la detección de anticuerpos contra agentes patógenos, tal como los patógenos virales, se utilizan muy frecuentemente y de forma muy ventajosa sistemas de detección de anticuerpos, según el formato del puente de doble antígeno, descrito por ejemplo en US 4.945.042. Los inmunoensayos, según este concepto de puente, requieren la utilización de un antígeno unido directa o indirectamente a una fase sólida y la utilización de este mismo antígeno o de un antígeno con reactividad cruzada fácilmente soluble, detectable directa o indirectamente. Los anticuerpos que se investigan, si están presentes, forman un puente entre el antígeno unido a la fase sólida y el antígeno de detección marcado. Solamente si los dos antígenos quedan unidos mediante anticuerpos específicos se genera una señal positiva.

Se han descrito diversos intentos de utilización de gp41 producida de forma recombinante como antígeno para la detección de anticuerpos anti-VIH. La gp41 producida de forma recombinante, con algunas limitaciones, puede utilizarse para detectar anticuerpos anti-VIH. Esta gp41 se utiliza o bien sola o en combinación con otros antígenos VIH para medir los anticuerpos anti-VIH. Actualmente, se conocen ensayos que se dirigen de forma independiente a la detección de antígenos VIH y/o anticuerpos anti-VIH. En WO 93/21346 se describe un ensayo combinado para la detección simultánea del antígeno gp24 y los anticuerpos contra gp41 de VIH-1 y gp36 de VIH-2. En este ensayo, se utiliza una fase sólida la cual se recubre directamente con gp41 producida de forma recombinante.

También está bien establecido que la utilización de valores de pH extraordinariamente altos o bajos es un modo de mantener gp41 (o gp36)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Inmunoensayo, según el concepto de puente de doble antígeno, que comprende: un primer antígeno que comprende un primer complejo chaperona-antígeno y un segundo antígeno que comprende un segundo complejo chaperona-antígeno, en el que dichos antígenos son proteínas amiloidogénicas y en el que dichas chaperonas son seleccionadas del grupo que consiste en SlyD y FkpA.

2. Inmunoensayo, según la reivindicación 1, en el que la primera chaperona y la segunda chaperona son moléculas distintas derivadas de una especie.

3. Inmunoensayo, según la reivindicación 1, en el que la primera chaperona y la segunda chaperona son derivadas de diferentes especies.

4. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera chaperona es derivada de una bacteria termofílica.

5. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la segunda chaperona es derivada de una bacteria termofílica.

6. Inmunoensayo, según la reivindicación 1 ó 3, en el que la primera chaperona y la segunda chaperona son derivadas de bacteria termofílicas.

7. Inmunoensayo, según la reivindicación 1, en el que el primer complejo de antígeno comprende un grupo de unión en fase sólida.

8. Inmunoensayo, según la reivindicación 1, en el que el segundo complejo de antígeno comprende un grupo marcador.


 

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